单管中多重靶核酸的PCR检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及在单个ＰＣＲ反应容器中多重检测样品中一种或几种靶核酸的实时ＰＣＲ方法，其包括，（１）在所述单个ＰＣＲ反应容器中混合样品、ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同；（２）进行ＰＣＲ反应，并实时检测不同波长的荧光；和（３）根据荧光检测结果计算出的Ｃｔ值判断是否有一种或几种靶核酸存在于样品中。另外，本发明专利技术还涉及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。该多重检测方法无需专门设备，因此可广泛用于实验室研究、食品安全、医药卫生等众多领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸检测
，具体而言，本专利技术涉及在单个PCR反应容器中多重检测 样品中靶核酸的PCR方法。另外，本专利技术还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，如内对照、 引物、探针等，以及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
技术介绍
聚合酶链反应(PCR)是当今核酸检测中最常用的技术之一，其中实时(RealTime) PCR 技术采用了诸如荧光标记等可实时检测的标记，在核酸检测、临床诊断及分子生物学研究等 方面的功用显得越来重要。这类技术目前应用领域非常广泛，已经在实验室研究、食品安全、 医药卫生等众多行业中得以使用了。除了常规的实时PCR检测，近年来人们对实时PCR检 测也做了大量改进工作。例如，中国专利申请CN1768151A、 CN101189505A、 CN101273262A、 CN101302473A等均记载了对传统的实时PCR的改进。但是，传统和改进的实时PCR (尤其 是实时荧光PCR)在进行实际样品的检测时，即使仅检测单一靶核酸，也必须面对样品中可 能存在的多种核苷酸对检测结果的干扰；当在单个PCR反应容器中进行多重靶核酸检测(即 同时检测多种靶核酸)时，由于要同时引入检测不同种靶核酸的引物和探针，因此还进一步 需要面对不同的引物和探针的相互干扰的问题。而面对这些难题，现有技术中往往采用操作 复杂、成本高的处理手段，甚至某些无法引入内对照监测系统来排除假阴性，或者引入的内 对照(分子)本身(通常是核酸)进一步加剧了与多种靶核酸、引物及其探针之间的相互干 扰。为了克服现有技术的不足，经过长期艰苦努力，本专利技术人令人惊讶地通过优选结果判别 方法、优化样品处理方法、选择内对照基因并任选包装成病毒样颗粒、和/或筛选出了引物和 不同波长区域的荧光标记的探针，开发出了在单个PCR反应容器(如，单个PCR反应管) 中多重检测样品中靶核酸的PCR方法，克服了实时荧光PCR开发中普遍遇到的多重引物/探 针容易交叉污染及灵敏度相对低的技术难点，而且对于单管检测，操作方便并节省成本，同 时采用全程内对照监控系统，保证试验的准确性。经过大量样本的验证，结果可靠，而且使用目前常规的市售实时荧光PCR设备，无需改造，就能使其特异性、灵敏度、重复性等技术 指标均达到国际先进水平。另外，本专利技术人还专利技术了用于上述方法的试剂，如内对照、引物、 探针等，以及检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供在单个PCR反应容器中多重检测样品中耙核酸的实时PCR方法， 该方法通过优化结果判别方法、优化样品处理方法、优化内对照基因并优化其包装形式、和/ 或优化出互不干扰的引物、探针以及荧光标记，可以在单个PCR反应容器中同时分辨出样品 中是否存在的不同种靶核酸，尤其可以同时分辨出RNA和DNA靶核酸，而无需专门设备或 试剂，也无需引入复杂实验步骤，就能得到高特异性、灵敏度和重复性的结果。另外，本发 明的目的还在于提供上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了在单个PCR反应容器中多重检测样品中一种或几 种靶核酸的实时PCR方法，其包括，(1) 在所述单个PCR反应容器中混合样品、DNA聚合酶、dNTP (即dATP、 dCTP、 dGTP 和dTTP)、内对照核酸、耙核酸引物对、内对照核酸引物对、 一种或几种靶核酸探针和内对 照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团 的荧光检测波长互不相同；(2) 进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和(3) 根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有一种或几种靶核酸存在于样品中。在本专利技术的第一方面，所述实时PCR方法所检测的样品是潜在可能含有靶核酸的离体样 品，如食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。所述实时PCR方法仅限于对离体 样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本专利技术的检测方法检测 人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否， 还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不 慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的 病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人 或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。 优选在本专利技术的第一方面的方法,中，样品是经过预处理而富集了核酸(如靶核酸)的样品，5如样品是经过磁珠提取法处理过的样品。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸 吸附类物质的顺磁性颗粒，在低pH(如，pH值5 7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁 性颗粒表面，在进行磁分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8 9)、低盐浓度的条件下可将 核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异 性吸附(如杂交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是 熟知的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中国法医学杂志，18 (3): 107-108;中 国专利申请200610030229.5等。在本文中，单个PCR反应容器指所述实时PCR方法在技术上是在同一个容器中进行 的，没有必要更换容器。最优选其中所述容器是PCR反应管，其它可以进行PCR反应并可 进行实时荧光检测的容器也在本专利技术的保护范围内。在本专利技术第一方面的实时PCR方法中， 在同一个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便 了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与各种试剂即可，就可以通过市售的普通实时荧 光PCR仪来自动完成，整个过程操作者只需添加样品和试剂即可，非常方便。尤其是，整个 过程只需添加样品和试剂的步骤干预，便于实现全自动操作，如使用中国专利申请 2007100030261公开的自动微量加液系统(即，吸取和分配实验液体的移液装置及带有该装 置的PCR仪)，即可完成本专利技术检测方法的全过程自动化，从而节约了人力成本并最大程度 降低了人为失误的可能性，因此本专利技术的检测方法便于自动化所带来的成本和可靠性优势是 可以预期的。在本文中，多重检测指的是同时检测的核酸有多种，即至少两种。在本专利技术的第一方 面的方法中，由于至少检测了内对照核酸和一种靶核酸，因此检测的核酸至少有两种。当要 检测的靶核酸种类不止一种时，和/或作为内对照的内对照核酸种类不止一种时，则同时检测 的核酸相应增加。其中，每种核酸可以是RNA,也可以是DNA。在本专利技术的具体实施方式 中，优选进行二重检测、三重检测、四重检测、或五重检测。多种靶核酸中优选既有RNA靶 核酸，也有DNA靶核酸。同样，多种内对照核酸中优选既有RNA内对照核酸，也有DNA 内对照核酸。优选在本专利技术的第一方面的方法中，在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混 合有PCR反应所需的其他试剂，如pH缓冲剂和盐。另外，还优选了甘油浓度，用以延长PCR 条件下酶活耐久力。在本专利技术的具体实施方式中，pH缓冲剂优选是Tris.HCl;盐优选是KC1。 本领本文档来自技高网...

【技术保护点】
在单个ＰＣＲ反应容器中多重检测样品中一种或几种靶核酸的实时ＰＣＲ方法，其包括，　（１）在所述单个ＰＣＲ反应容器中混合样品、ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前 述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同；　（２）进行ＰＣＲ反应，并实时检测不同波长的荧光；　（３）根据荧光检测结果计算出的Ｃｔ值判断是否有一种或几种靶核酸存在于样品中。

【技术特征摘要】
1，在单个PCR反应容器中多重检测样品中一种或几种靶核酸的实时PCR方法，其包括，(1)在所述单个PCR反应容器中混合样品、DNA聚合酶、dNTP、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同；(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有一种或几种靶核酸存在于样品中。2，前述任一权利要求所述的方法，其中在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混 合有反转录酶。3，前述任一权利要求所述的方法，其中靶核酸优选有一种、两种或三种，其中每种靶核酸分 别是RNA或DNA，优选是病原体RNA或DNA，更优选是病毒RNA或DNA，最优选是HCV RNA、 HIVRNA或HBVDNA。4，前述任一权利要求所述的方法，其中样品是经过磁珠提取法处理过的样品。5，前述任一权利要求所述的方法，其中内对照核酸是新霉素抗药性基因或其片段，优选所述 基因或其片段被包装在病毒样颗粒内。6，前述任一权利要求所述的方法，其中各种探针标记有不同的荧光基团。7，前述任一权利要求所述的方法，其中靶核酸探针的核苷酸序列选自HCV的5'非编码区 中的连续序列或其互补序列、HIV的gag基因中的连续序列或其互补序列、和HBV的编码S 抗原的基因中的连续序列或其互补序列。8，前述任一权利要求所述的方法，其中PCR反...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文艳，叶成果，龚华斐，杨国翠，李振勇，黄道培，
申请(专利权)人：上海浩源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]