抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了抗鼠神经生长因子（ＮＧＦ）的多克隆抗体的制备方法及其在酶联免疫测定方法中的应用。用于鼠颌下腺ＮＧＦ为免疫原制备的多克隆抗体可以用来定量检测小鼠生长因子。由此组装的试剂盒可以测定不同组织细胞神经生长因子的定位、表达以及检测血液、细胞、组织、培养基上清等不同样品中ＮＧＦ含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的制备方法，和检测神经生长因 子(NGF)的ELISA试剂盒。技术背景神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是意大利科学家Levi-Montalcini 1953 年发现的神经营养因子，是目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突触生长双重生物 学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生 和功能特性的表达均具有重要的调控作用。1960年，美国科学家Cohen提取纯化NGF，并 证明其生物活性。1986年，Montalcini和Cohen因对NGF的杰出研究而荣获诺贝尔生理 医学奖。90年代至今，国内外多家制药公司和药物研究机构相继开始进行NGF开发研究。 目前已开发出多种NGF试剂。NGF包括ci、 e、 Y三个亚单位，其中a亚单位功能尚不清楚，Y亚单位具有蛋白 酶活性，e亚单位是NGF的活性亚单位。活性区P亚单位由两个118个氨基酸组成的单 链通过非共价键结合而成的二聚体。NGF在人体内主要分布于脑、神经节、虹膜、心脏、 脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等。目前NGF主要来源于雄性小鼠颌下腺(与人类NGF有90X同源性)、牛精浆、蛇毒、 和豚鼠前列腺。分子量为140kD(7sNGF,由a 、 p 、 Y三个亚单位和锌离子构成)和13kD 14kD(2.5s NGF，结构与e亚基基本相同。故又称为P -NGF)。NGF与受体结合，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、 并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经酪氨酸蛋白激酶、酯酰肌醇 f!、内源性环腺苷酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构 或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。定性和定量地测定神经生长因子(NGF)的活性，对医药领域具有重大的作用。现有 的NGF质量控制标准是采用鸡胚背根神经节法，测定NGF的生物学活性，由于该法实验误差大，结果判定易受主观因素影响。所以建立快速、准确、客观的NGF含量的测定方法， 不仅有利于NGF质量控制，也可用于NGF的药代动力学研究，但这都需要NGF抗体的制备 的获得和检测方法的建立。由于NGF的免疫原性较弱，很难获得抗体，在国内NGF高效价 抗体获得还是一个空白。本专利技术通过特殊处理的NGF免疫兔子获得了高效价的NGF抗体, 并将其制成检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的方法；本专利技术的另一目的在于利用上述方法制备的多克隆抗体,制备一种可以定量检测神经 生长因子(NGF)的ELISA试剂盒，来检测不同细胞、组织中神经生长因子(NGF)的定位 及表达；该试剂盒可检测血、培养上清、细胞、组织等不同样品中神经生长因子(NGF)。为了解决上述问题，本专利技术采用的技术方案是一种抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体的制备方法 采用纯化的鼠颌下腺神经生长因子(NGF)作免疫原，采用戊二醛聚合NGF后，免疫 正常家兔，收集血清，从中分离纯化出抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体。前述的一种抗鼠神经生长因子(NGF)的多克隆抗体制备方法，包括以下步骤a、 纯化的NGF经0.1%-0. 5%戊二醛聚合后按照10 " g~500 u g/只，与等体积完全弗 氏佐剂充分混合、乳化，皮下多点注射正常家兔；b、 2周 4周后，纯化的并经0.1%-0. 5%戊二醛聚合的NGF与等体积不完全弗氏佐剂 充分混合、乳化，再次皮下多点注射；c、 2周 4周后，重复步骤b;d、 末次免疫一周后采耳血，间接ELISA方法测效价，大于l: 1000即可；e、 耳缘静脉采血，收集血清，一20'C保存。 前述的制备的抗鼠神经生长因子(NGF)多克隆抗体的制备，还包括以下纯化步骤(1) 、制备抗原亲合柱(2) 、结合缓冲液(PBS)充分平衡抗原偶联的亲和层析柱；血清与PBS混合后，反复上样3次；(4) 、 PBS充分洗涤，去除未结合蛋白；(5) 、洗脱缓冲液洗涤特异结合的抗免疫抗原的多克隆抗体，收集至加有适量10XPBS pH7.6的烧杯中；(6) 、透析至1XPBS中，蛋白定量，分装，一20'C保存。上述纯化步骤中，抗原亲合柱的制备，包括纯化的抗原(小鼠颌下腺神经生长因子 NGF)透析于偶联缓冲液中，预冷的0. 5mM 50 mM HC1洗涤CNBr—活化的s印harose 4 fast flow胶数次，负压超滤，并置换于偶联缓冲液中；将抗原与活化的胶粒混合，4'C搅拌过 夜；用偶联缓冲液洗涤未完全结合的抗原；封闭缓冲液室温作用0.5小时以上，封闭未被 抗原饱和的活化位点；洗涤缓冲液交替洗涤2次以上，偶联抗原的胶粒保存于20%的酒 精中。上述纯化步骤中，兔多克隆免疫血清与PBS的混合比为1: 2 1: 5; 上述纯化步骤中，上样的流速为O. 1 ml/min 1 ml/min; 上述纯化步骤中，洗脱缓冲液为0.1M盐酸一甘氨酸缓冲液，pH2.8; 上述纯化步骤中，偶联缓冲液为O.lmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH8.3; 上述纯化步骤中，封闭缓冲液为封闭缓冲液为0.2 mol/L甘氨酸； 上述纯化步骤中，洗涤缓冲液为醋酸盐缓冲液0.1 mol/L CH3COONa和0.5 mol/L NaCl, pH4.0)。上述方法制备的抗鼠神经生长因子(NGF)多克隆抗体，可以用来中和NGF的 生物学活性。可以作各种标记，用以组建检测血液、尿样、培养上清和各种细胞、组织中 鼠神经生长因子(NGF)含量的试剂盒。纯化也可采用硫酸氨一正辛酸法取一定体积的血清，用0.06 mol/L pH4.8的 HAc-NaAc缓冲液稀释2倍或4倍；逐滴加入正辛酸，使终浓度为75 w 1/ml (正辛酸/兔血 清)，并搅拌30min,室温下12000 r/min离心20 min后取上清液；加入体积为上清1/10 的0.1 mol/L pH7.4的PBS溶液，静置2小时或4'C过夜；4'C 12000 r/min离心30 min， 弃上清；将沉淀溶于一定体积的0. 01 mol/L pH7. 4的PBS中，用50 100倍体积的0. 01mol/L pH7. 4的PBS于4'C透析过夜。 本专利技术的另一技术方案是一种检测NGF的ELISA试剂盒，采用抗鼠神经生长因子(NGF)多克隆抗体为捕获抗体， 识别并结合待测标本中的NGF，采用a、 以生物素标记的抗鼠颌下腺神经生长因子(NGF)多克隆抗体为检测抗体，通过亲 和素/链霉亲和素一一辣根过氧化物或亲和素/链霉亲和素一一碱性磷酸酶催化底物显色; 或b、 以酶标记的抗鼠颌下腺神经生长因子(NGF)多克隆抗体为检测抗体，直接加底物 显色；或c、 以抗鼠颌下腺神经生长因子(NGF)多克隆抗体为二级抗体，以酶标记的山羊的抗 兔抗体为三级抗体，催化底物显色。然后根据标准品0D值绘制标准曲线，在标准曲线上査出待测标本中神经生长因子 (NGF)的含量，试剂盒包括包被抗体1支、检测抗体1支、神经生长因子(NGF)标准品 1支、底物液1支、96孔ELISA板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗鼠神经生长因子（ＮＧＦ）的多克隆抗体的制备方法，采用纯化的鼠颌下腺神经生长因子（ＮＧＦ）作免疫原，采用戊二醛聚合ＮＧＦ后，分批次免疫正常家兔，加强免疫后一周收集血清，从中分离纯化出抗鼠颌下腺神经生长因子（ＮＧＦ）的多克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：任宏伟，邹宇飞，熊玲媛，马彬云，孙朗，杨幼瑶，马凌燕，付永超，吴敏华，
申请(专利权)人：任宏伟，邹宇飞，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]