本发明专利技术公开了一种地衣芽孢杆菌菌株，菌株保藏名称为地衣芽孢杆菌ＷＸ－０２，保藏单位ＣＣＴＣＣ，保藏编号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０８０６５，保藏日期２００８年４月２４日。本发明专利技术同时公开了该菌株的一种用途以及该菌株用于生产聚γ－谷氨酸的方法。本发明专利技术通过种子液制备、液体深层发酵工艺生产聚γ－谷氨酸产品，所属菌株遗传性能稳定、生产效率高、生产成本低。利用本发明专利技术的菌株及其发酵方法制备聚γ－谷氨酸３０００Ｌ发酵罐产量可达３５．０５ｇ／Ｌ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及芽孢杆菌及其用途，具体地说是地衣芽孢杆菌菌株及用途和用 其生产聚Y-谷氨酸的方法。
技术介绍
地衣芽孢杆菌(Sflc///^丄/c/2em/w7m》是一类自然界广泛存在的兼性厌氧腐 生菌。在工业上常常作为蛋白水解酶、淀粉酶、生物活性剂、抗生素等的生产 菌。目前已有研究者采用特定的地衣芽孢杆菌生产聚Y-谷氨酸，如有人采用地 衣芽孢杆菌A35生产聚Y-谷氨酸(详见参考文献1: Cheng C, Asada Y， Aaida T. Production of y-polyglutamic acid by 5c/〃ws //c/ ewi/brw/ A3 5 under denitrifying conditions. Agric Biol Chem， 1989， 53:2369—2375;)。但采用该菌 株生产聚.Y-谷氨酸存在发酵周期长，发酵产率低的缺陷。为了解决这一问题， 有研究者公开了一种采用地衣芽孢杆菌(凡ATCC9945A)生产聚 Y-谷氨酸的方法(详见参考文献US Patent 5378807， 1995;Yoon SH，DO JH， Lee SY. Production of poly-y-glutamic add by fed-batch culture of 5ac///ws //c/^w/o/Tmi Biotechnology Letters ，2000,22: 585—588)。上述方法虽然对聚， 谷氨酸的产量有所提高，但其在发酵过程中需添加高浓度的甘油，故其生产成 本高。由于聚，谷氮酸[Poly(Y-glutamic acid), PGA](以下简称y-PGA))在 医药、工业、农业等领域具有广阔的应用前景，因此，专利技术一株具有良好生产 Y-PGA特性的地衣芽孢杆菌就具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术目的就是要提供一种可克服现有地衣芽孢杆菌菌株缺陷的新地衣芽 孢杆菌菌株，同时提供一种该菌株的用途以及用该菌株生产聚，谷氨酸的方法。 本专利技术的目的是这样实现的本专利技术所提供的新的地衣芽孢杆菌菌株，其保藏名称为一株地衣芽孢杆菌 WX-02，保藏单位在CCTCC，保藏编号为CCTCC NO: M208065。保藏日期2008年4月28日。本专利技术的菌种的分离与筛选方法是称取湖北应城盐矿高盐环境土样lg于灭菌试管中，加无菌水9mL，用棉塞 封口，振荡2min，然后放水浴锅中，8(TC加热10分钟，再静置30 min。冷却 后，吸取上清液O.l mL，稀释l(T2 ， l(T3，分别取0.2 mL，涂布LB平板，37 。C培养48h观察结果，挑选在LB培养基上呈乳液状能拉丝的单菌落，接入新 鲜液体种子培养基中，37t:摇床培养12h后，按2%的接种量分别接种到装有50 mL灭菌基本发酵培养基的250 mL摇瓶中，37°C， 190 r/min，振荡培养36h结 束发酵。对发酵产物分别取样离心除去菌体，用3倍乙醇沉淀上清液，轻轻振 荡后12000 r/min离心15 min，收集沉淀物，冷冻干燥，再加入蒸馏水溶解沉淀 物，透析去除离子，利用HPLC检测产物。将筛选到的菌株按照规定方法进行 菌种鉴定。本专利技术所提供的新地衣芽孢杆菌菌株菌f直杆状，革兰氏染色阳性，芽孢 近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落圆形，边缘不齐，毛发状，菌苔干 燥，不透明，蔓延，灰白色。最适生长温度30-37，适宜pH6.8-7.2。接触酶实 验阳性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。本专利技术所提供的新地衣芽孢杆菌菌株16S rRNA基因序列有1263个碱基， 经采用Genebank登记号EU564336对比16S rRNA分子鉴定与前面的生理生 化鉴定结果结合分析，鉴定为芽孢杆菌属地衣芽孢杆菌。本专利技术的第二个目的是提供一种该地衣芽孢杆菌菌株的用途，即该菌株用 于生产聚Y-谷氨酸。本专利技术同时提供了一种用该菌株生产聚Y-谷氨酸的方法。该方法包括以下 步骤a、 采用地衣芽孢杆菌WX-02、保藏单位CCTCC、保藏编号为CCTCCNO: M208065、保藏日期2008年4月24日的菌株作为生产菌株；b、 将上述WX-02菌株接在LB培养基固体斜面上3(TC-37。C培养；刮取菌 苔至无菌的20%甘油保藏管中；一60 一70。C冷冻保藏；C、制备种子液(1) 将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，'3(TC-37'C培 养24-36小时，使其活化；LB固体培养基的优选配方为蛋白胨1-10克/升、酵母浸出物l-5克/升、 NaCll-10克/升、琼脂10-20克/升，pH 6.0-8.0。LB固体培养基更为优选配方为蛋白胨'3-5克/升、酵母浸出物3-5克/升、 NaCl 5-10克/升、琼脂15-20克/升、pH 6.0-8.0。(2) 将上述活化的种子转接到L B液体种子培养基中，30°C-37°C， 200rpm 培养14-16小时至对数生长中期；d、 发酵培养(1)按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基谷氨酸钠7-100克；碳源10-100克；无机氮源3-20克；K2HP04 '3H20 0.1-2克；MgS04'7H20 0.1-2克； FeCl3'6H20 0.01-0.1克；CaCl2.2H20 0.1-2克；MnS04 0.01-0.2克；ZnS04 0.1-2 克，补充蒸馏水至lOOOmL， pH 6.0-7.5; .(2 )按50-100mL/500mL三角瓶的装液量，投入上述培养基，121°C，30min 灭菌后，接种量为1-5%, 30-37。C培养24-48小时；或按发酵罐容积的40-80% 投入上述发酵培养基，以0.07-0.1Mpa高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至30°C -37°。接入种子液；在30。C-37。C条件下培养，通气量l: 0.5-2(v/v); 其中谷氨酸钠的优选含量为20-100克/升。发酵培养基中的无机氮源优选硫酸铵、氯化铵、尿素、硝酸铵、或硝酸钠。 无机氮源含量优选5-20克/升。培养基中的碳源优选葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉、或淀粉水解液。 碳源含量优选30-100克/升。e、 提取将d步骤所述的菌株培养液深层发酵24-48小时；离心除去菌体、收集上 清液，并用95%的乙醇沉淀、回收聚-Y-谷氨酸。本专利技术所提供的地衣芽孢杆菌菌株wx-02在用于生产聚Y-谷氨酸时，其效 果明显优于现已知的地衣芽孢杆菌菌株。其总体表现在以下几个方面(1)发酵周期短，生产效率高本专利技术的菌株在实验室3L发酵罐中发酵周6期为28-36小时，聚Y-谷氨酸产量可达到42g/L;在中试3000L发酵罐 产量达到35.05g/L,扩大过程中产量稳定。(2) 发酵工艺相对简单如不需要补料控制及温度、pH值的控制。发酵过 程中不起泡，不需要控制泡沫，不会发生逃液及染菌现象。(3) 生产成本低培养基中不需要添加甘油和有机氮源，发酵成本低，培 养基无色透明，易于产物分离提取。(4) 遗传稳定性好。该菌株遗传操作简单，可制备高感受态细胞，转化效 率高。遗传性能稳定，连续传代20次以上，该菌株合成聚，谷氨酸的 能力不变。本专利技术用于生产聚Y-谷氨酸时发酵周期短、生产效率高的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株保藏名称为地衣芽孢杆菌ＷＸ－０２，保藏单位ＣＣＴＣＣ，保藏编号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０８０６５，保藏日期２００８年４月２４日。
【技术特征摘要】
1、一种地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株保藏名称为地衣芽孢杆菌WX-02，保藏单位CCTCC，保藏编号为CCTCC NOM208065，保藏日期2008年4月24日。2、 根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株的用途，其特征在于该菌株用 于生产聚，谷氨酸。3、 根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌齒株用于生产聚，谷氨酸的方法， 其特征在于它包括以下步骤a、 采用地衣芽孢杆菌WX-02、保藏单位CCTCC、保藏编号为CCTCC NO: M208065、保藏日期2008年4月24日的菌株作为生产菌株；b、 上述wx-02菌株接在LB培养基固体斜面上30。C-37t:培养；刮取菌苔至 无菌的20%甘油保藏管中；-60 -70匸冷冻保藏；C、制备种子液(1) 将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，3(TC-37'C培养 24-36小时，使其活化； ，(2) 将上述活化的种子转接到L B液体种子培养基中，30°C-37°C， 200rpm 培养14-16小时至对数生长中期；d、 发酵培养(1)按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基谷氨酸钠7-100克；碳源10-100克；无机氮源3-20克；K2HP04 '3H20 0.1-2克；MgS04'7H20 0.1-2克； FeCl3.6H20 0.01-0.1克;CaCl2.2H20 0.1-2克;MnS04 0.01-0.2克;ZnS04 0.1-2 克，补充蒸馏水至lOOOmL， pH 6.0-7.5;(2 )按50-100mL/500mL三角瓶的装液量，投入上述培养基，121°C， 30min 灭菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，谢萍，魏雪团，刘晓雷，冀志霞，郭威，张红艳，孙君伟，李海涛，李建波，米造吉，黄品奇，王正品，
申请(专利权)人：河北维尔康制药有限公司，华中农业大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]
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