一种弓形虫PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种弓形虫ＰＣＲ检测方法，所述的检测方法包括步骤：（１）将引物、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、和ＰＣＲ产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；（２）将步骤（１）得到的粉末和样品混合，进行ＰＣＲ反应，得到ＰＣＲ产物；和（３）将ＰＣＲ产物进行电泳检测；所述样品包括抽提自哺乳动物尿液和／或粪便的核酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学及实验动物寄生虫质量控制
，尤其涉及弓形 虫PCR检测方法。
技术介绍
现行国家标准中的弓形虫检测依仗血清学检测，然而血清学检测存在无法 避免的滞后性以及难以检测环境中的病原体。在实验动物质量控制新国标修订稿中列举了弓形虫检测的PCR方法。该方 法是对原有血清学方法(IHA、 IFA、 ELISA等)的有效补充。但是仍需要处死 动物，并且检测方法相对繁琐。由于PCR是以指数方式扩增，极微量的DNA污染都可能造成假阳性结果， 因此反应体系的干净程度是绝对重要的。现有技术中，需要自行加入各种PCR 反应组分，容易发生核酸污染，干扰检测结果。参照修订稿中的操作流程，需 要在PCR操作时分7次加入PCR反应组分以及反应过后电泳前的上样缓冲液， 共8次需要移取试剂加入PCR反应管。耗时费力，且人为操作不慎，操作地点 设备(如超净工作台失效)，甚至PCR操作区域布局不当，都使反应体系受污 染的机率大大增加，会直接改变PCR结果，影响诊断。另外，在该修订稿中，仍需要处死动物釆取腹水、其他组织或采取大量血 液(0.2毫升已经超过小鼠最大安全采血量)作为样品，每检测一只动物就必 须处死或者采血造成动物伤害。因此，本领域迫切需要提供一种简便、有效的实验动物弓形虫PCR检测方 法，并且无需处死动物。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种实验动物弓形虫PCR检测方法。在本专利技术中，提供了一种弓形虫PCR检测方法，所述的检测方法包括步骤(1) 将引物、T叫DNA聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、和 PCR产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；(2) 将步骤(1)得到的粉末和样品混合，进行PCR反应，得到PCR产物；和(3) 将PCR产物进行电泳检测；所述样品包括抽提自哺乳动物尿液和/或粪便的核酸。在另一优选例中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。在另一优选例中，所述的缓冲液是10X PCR缓冲液，其中含有氯化钾， Tris-HC1，和Triton X-100。在另一优选例中，所述的10X PCR缓冲液的配方是5 0 OmM氯化钾，1 0 0mMTris-HCl， 1 v/v%Triton X-100，和双蒸水。在另一优选例中，PCR产物电泳前的上样缓冲液是10X上样缓冲液，其中含 有丙三醇，和GelRecF 。在另一优选例中，所述的10X上样缓冲液的配方是5 Ov/v^丙三醇，和 0. 05v/v%GelRed 。在另一优选例中，所述的Taq DNA聚合酶为红色。在另一优选例中，所述的哺乳动物选自灵长类动物、猫科动物、犬科动物、 或啮齿类动物。在另一优选例中，所述的哺乳动物选自猴子、猪、猫、犬、大鼠、或小鼠。 在另 一优选例中，所述的样品还包括阳性对照品和阴性对照品。据此，本专利技术提供了一种简便、有效的实验动物弓形虫PCR检测方法，并 且无需处死动物。附图说明图1显示了实施例1中的检测电泳图；其中A显示的是DL2000标记物的电 泳结果，B显示的是标准阳性片段的电泳结果。具体实施方式专利技术人在实践中发现可以通过检测实验动物的排泄物，如尿液和/或粪便，用PCR的方法检测弓形虫是否存在，并且所述的用于检测的PCR试剂是一次性加入， 避免了由于操作歩骤繁多而可能造成无法准确检测的后果。如本文所用，"PCR"是指聚合醇链反应(polymerase chain reaction, PCR)，是本领域技术人员熟知的用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性-退 火-DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增的一项分子生物学 技术。本专利技术中所使用的聚合酶稳定剂是上海赛百盛基因技术有限公司的产品。 Tris是指三羟甲基氨基甲烷(Tris(Hydroxymethyl)ami画ethane)。 Triton X-100是指曲拉通X100(Amresco)。GelRed荧光核酸染色试剂(GelRed Nucleic Acid Stain)是美国Biotium Inc.的产品，GelRed 是一种灵敏、稳定和相对安全的荧光核酸染色试剂。它 可以替代高毒性染色剂一溴化乙锭(EB)，用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 中dsDNA和ssDNA的染色。GelRed 既可用于预制凝胶也可用于电泳后染色。本专利技术提供的弓形虫PCR检测方法包括步骤.-(1) 将引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、 和PCR产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；(2) 将步骤(1)得到的粉末和样品混合，进行PCR反应，得到PCR产物；和(3) 将PCR产物进行电泳检测，确定样品中是否存在弓形虫。 本专利技术对于PCR反应所需试剂，先进行预混和冻干制备。PCR反应需要的反应组分有缓冲液、Taq酶、引物2条、dNTP、样品(或阴、阳性对照)、水。 在本专利技术的一个优选例中，按照国标修订稿中的弓形虫PCR检测方法中规定的 上述组分的浓度，配置试剂后进行预混和分装，每个PCR反应管中加入T叫DNA 聚合酶、单次 PCR 引物按弓形虫 Bl 基因序列设计 5， GGAACTGCATCCGTTCATGAG3' (694-714bp， SEQ ID NO: 1); 5' TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3'(887-868bp， SEQ ID NO: 2)，预计扩增产物 为194bp。 10XPCR反应缓冲液(含MgCl2 15mM)以及10 dNTP:各为lOmM， 并加入PCR产物电泳前的上样缓冲液。预混分装后进行冻干。冻干的目的是去 除预混溶液中的水分，防止预混成分的变性和降解。由于去除了水分，预混后的PCR管中反应组分呈粉末状。为了保证每一管中均含有Taq酶，避免PCR预 混管的核心组分差异，采用红色的Taq酶，所以预混冻干后，PCR反应管底部 可见红色粉末。本专利技术将预混和冻干的PCR反应试剂和提取自哺乳动物排泄物的样品混合， 进行PCR反应，得到PCR产物。在常规PCR实验中，由于反复冻融和抽取，可能导致试剂的浪费和交叉污 染，增加出错的机率。本专利技术PCR反应管在使用时，因原有溶液组分已被冻干 成为粉末，只需加入样品，再补足水至原定的反应体系(50或20微升体系) 即可。PCR操作中向PCR反应管中加溶液縮短为2次，而不是传统的7次。预 混的试剂也避免了操作中因多次加样，可能发生的核酸污染。由于已经预混了 上样缓冲液，PCR反应结束后，电泳前也不用预混上样缓冲液，经存放期试验， 该试剂盒在-2(TC条件下能存放一年仍然有效，室温下存放十五天之内不影响 检测效果。本专利技术采用动物尿液和粪便作为样品，可以检出弓形虫阳性结果。在人工 感染后80小时，可以从尿液和粪便中查出相应的核酸序列， 一方面说明弓形 虫核酸在小鼠体内的代谢规律，另一方面说明PCR方法在通过尿液和粪便样品 检测弓形虫的可行性。后续的血清学IHA试验的结果说明弓形虫感染的小鼠在 已能从排泄物中检出阳性序列的40小时之后，仍未能从其血清中检测到的特 异性抗体。通过排泄物检测弓形虫指标，可以避免伤害或处死动物，对于某些 价值较高的基因工程小鼠的质量检测有很重要的意义，是对于减少、替代和优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种弓形虫ＰＣＲ检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括步骤：　（１）将引物、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、和ＰＣＲ产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；　（２）将步骤（１）得到的粉末和样品混合，进 行ＰＣＲ反应，得到ＰＣＲ产物；和　（３）将ＰＣＲ产物进行电泳检测；　所述样品包括抽提自哺乳动物尿液和／或粪便的核酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡建华，濮俊毅，高诚，
申请(专利权)人：上海实验动物研究中心，
类型：发明
国别省市：31[]