本发明专利技术涉及ＰＣＲ检测领域，具体涉及一种利用多重ＰＣＲ检测鸭粪中三种原虫的方法，其中所述原虫为贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫。本发明专利技术检测方法是根据鸭环孢子虫ＩＴＳ－１基因，菲莱氏温扬球虫１８Ｓ?ｒＲＮＡ基因和贝氏隐孢子虫ＩＴＳ－１＋片段，分别设计出３对特异性引物，通过多重ＰＣＲ反应可以快速准确地检测鸭粪中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫卵囊，对鸭的隐孢子虫病、环孢子虫病和球虫病作出鉴别诊断。本发明专利技术检测方法可以同时检测三种原虫，敏感性、特异性好，比常规ＰＣＲ更加快捷经济，可用于鸭肠道原虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查或水源性隐孢子病和环孢子虫病爆发的风险评估。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及PCR检测领域，具体涉及一种利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法。
技术介绍
鸭肠道中可蕴藏和感染多种寄生性原虫，这些原虫随粪便排出体外，可以在鸭群 中相互传播，甚至有的还可以感染人类，这不仅对其自身的生存和养禽业的发展造成严重 的危害，还可以对人类健康构成威胁。其中，菲莱氏温扬球虫是引起鸭球虫病的主要病原 体，贝氏隐孢子虫和环孢子虫可导致人兽共患的寄生虫病，它们对养殖业及人类健康构成 了严重威胁。由于鸭肠道寄生虫在临床上都能引起共同的消化道症状，又常呈混合感染，通过 临床诊断难以区别。常规的病原诊断方法是病原分离，然后镜检，此法费时费力、敏感性和 特异性都较差，且对检测人员专业知识的要求较高，因此，建立特异、敏感的检测方法十分必要。聚合酶链式反应(PCR)是以两段寡核苷酸为引物，由DNA聚合酶催化扩增位于两 段引物之间的DNA片段的一项分子生物学技术。该技术自1983年建立以来，因其高灵敏度、 高效率、高特异性的特点，已成为当前生命科学与相关领域中的关键技术。PCR技术广泛应 用的同时，又推动自身发展了一系列相关技术，如巢式PCR、实时定量PCR、差异显示PCR、免 疫PCR、多重PCR等。常规PCR技术一次PCR反应只能检测或诊断一种病原体，当临床上出现多种病原 体混合感染时，必须进行多次的PCR反应才能确诊。Chamberlain等(1988)最先提出“多 重PCR (Multiplex PCR)”这一概念。它是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应 体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段 的PCR技术。由于多重PCR同时扩增多个目的基因，该技术用于病原检测或鉴别诊断时，可 一次同时检测几种病原体，具有高特异性、高效率、低成本的优势，尤其可节省珍贵的试验 样品，具有很高的临床应用价值。目前，国内外已有不少关于建立多重PCR方法检测人或畜禽寄生虫病的报道。 Verweij等(2004)利用多重Real-time PCR技术检测粪便中的阿米巴、贾第虫和隐孢子虫。 Haque等(2007)针对阿米巴、贾第虫和隐孢子虫分别设计一对引物和一个探针，利用多重 Real-time PCR技术检测人的粪便，对比金标准诊断方法，多重Real-time PCR技术的敏感 性为89%，特异性为99%。Eligio-Garcia等(2008)利用多重PCR检测贾第虫的多个基因 型。Hove等(2009)利用多重Real-time PCR技术检测人粪便中的阿米巴、贾第虫、隐孢子 虫和类圆线虫，结果显示利用该方法可快速诊断腹泻病人是否感染寄生虫及其所感染的寄 生虫种类。但迄今尚无一种多重PCR方法对鸭肠道原虫的混合感染进行检测或诊断。与常 规PCR相比，多重PCR不但保持了较高的特异性和敏感性，而且较之更为快捷经济；同时在 检测未知病原混合感染上具有无可比拟的优势。如今多重PCR已经成为临床疾病实验室诊断或排查的重要手段，它与传统的经典方法相结合，为疾病的快速诊断展示了广阔的应用 前景。因此，鸭三种原虫多重PCR检测方法的建立已成为人们多年来盼望实现的目标。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有PCR检测畜禽寄生虫病中存在的一次PCR只能检测一 种寄生虫的问题，提供一种利用多重PCR技术，同时检测鸭粪中三种原虫的方法。本专利技术目的通过以下技术方案予以实现一种利用多重PCR检测鸭粪中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫的方 法，是根据环孢子虫ITS-I基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS-I+片 段，分别设计出3对特异性引物，第一对引物的名称为CDl和CD2，第二对引物的名称为WFl 和WF2，第三对引物的名称为CBl和CB2，引物序列如SEQ ID NO 1 6所示，通过多重PCR 反应可以快速准确地检测鸭粪中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫卵囊，对鸭 的隐孢子虫病、环孢子虫病和球虫病作出鉴别诊断。根据鸭源环孢子虫ITS-I (374bp，如SEQ ID NO :7所示)、菲莱氏温扬球虫18S rRNA(422bp，如SEQ ID NO :8所示)和贝氏隐孢子虫ITS-I+(694bp)序列设计多重PCR引 物。本专利技术方法包括如下步骤(1)采集待检粪样，对样本进行预处理，提取样本中的虫体DNA ；(2)根据环孢子虫ITS-I基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫 ITS-I+片段，分别设计出3对特异性引物，引物序列如SEQ ID N0:1 6所示;(3)利用上述引物和提取到的虫体DNA进行多重PCR反应；(4)若在与阳性对照同一位置出现目的条带，则对应的样本为鸭隐孢子虫、环孢子 虫和球虫阳性。根据多重PCR引物确立了鸭三种原虫多重PCR的反应体系和反应条件多重PCR反应的体系为10 X PCR 缓冲液2.5yLdNTPs (2. 5mmol/L)2. 5 μ LMg2+(25mmol/L)2. 0 μ L Ex-Taq 酶(5U/ μ L)0. 2 μ L环孢子虫ITS-I 引物(25nmol/L)各 1. 6 μ L菲莱氏温扬球虫18S rRNA引物(25nmol/L)各1. 8 μ L贝氏隐孢子虫ITS-I+引物(25nmol/L)各1. 0 μ L3种原虫的DNA模板各2. 0 μ LddH20加至 25.0 μ L。多重PCR反应的条件为预变性940C，5min ；变性94°C，30s ；退火47. 6°C，40s ；延 伸72°C, Imin ；终延伸72°C, IOmin ；其中，变性、退火和延伸为35个循环。作为一种最优选方案，本专利技术利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法包括如下 步骤(1)样本的预处理取样本10g，用PBS-0. 1 % Tween稀释到20mL，旋涡振荡，用100目尼龙筛过滤，滤液2000r/min离心lOmin，反复用PBS液洗涤三次，离心，取沉淀备用；(2)样本DNA的提取；(3)多重PCR扩增扩增体系如下扩增条件为预变性94°C，5min ；变性94°C，30s ；退火47. 6 °C，40s ；延伸72 °C, Imin ；终延伸72°C, IOmin ；其中，变性、退火和延伸为35个循环；(4) PCR产物观察取扩增产物加样于琼脂糖凝胶上，电泳后，紫外灯下观察到一 条与阳性对照同一位置出现的288bp、402bp和694bp的片段，即为鸭隐孢子虫、环孢子虫和 球虫阳性。本专利技术建立的多重PCR方法，可用于鸭肠道原虫病的鉴别诊断和分子流行病学调 查或水源性隐孢子病和环孢子虫病爆发的风险评估。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术根据鸭环孢子虫ITS-I基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子 虫ITS-I+片段，分别设计出3对特异性引物，通过多重PCR反应可以快速准确地检测鸭粪 中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫卵囊，可以同时检测三种原虫，敏感性、特 异性好，比常规PCR更加快捷经济，具有广阔的应用前景。具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实验例1单项PCR特异性试验将抽提的三种原虫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用多重ＰＣＲ检测鸭粪中三种原虫的方法，所述原虫为贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫，其特征在于所述检测方法是根据鸭环孢子虫ＩＴＳ－１基因，菲莱氏温扬球虫１８Ｓ ｒＲＮＡ基因和贝氏隐孢子虫ＩＴＳ－１＋片段，分别设计出３对特异性引物，引物序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～６所示，通过多重ＰＣＲ反应结果来检测样本是否为鸭隐孢子虫、环孢子虫和球虫，其中，鸭环孢子虫ＩＴＳ－１基因的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７所示，菲莱氏温扬球虫１８Ｓ ｒＲＮＡ基因的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ：８所示。
【技术特征摘要】
一种利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法，所述原虫为贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫，其特征在于所述检测方法是根据鸭环孢子虫ITS 1基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS 1+片段，分别设计出3对特异性引物，引物序列如SEQ ID NO1～6所示，通过多重PCR反应结果来检测样本是否为鸭隐孢子虫、环孢子虫和球虫，其中，鸭环孢子虫ITS 1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO8所示。2.根据权利要求1所述的利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法，其特征在于所述 方法包括如下步骤(1)采集待检粪样，对样本进行预处理，提取样本中的虫体DNA；(2)根据环孢子虫ITS-I基因，菲莱氏温扬球虫18SrRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS-I+ 片段，分别设计出3对特异性引物，引物序列如SEQ ID N0:1 6所示；(3)利用上述引物和提取到的虫体DNA进行多重PCR反应；(4)若在与阳性对照同一位置出现目的条带，则对应的样本为鸭隐孢子虫、环孢子虫和 球虫阳性。3.根据权利要求2所述的利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法，其特征在于步骤⑶中所述多重PCR反应的体系为10XPCR 缓冲液2. 5yLdNTPs(2. 5mmol/L)2. 5 μ LMg2+(25mmol/L)2. 0 μ LEx-Taq 酶(5U/ μ L)0. 2 μ L环孢子虫ITS-I引物(25nmol/L)各1· 6 μ L菲莱氏温扬球虫18S rRNA引物(25nmol/L)各1. 8 μ L贝氏隐孢子虫ITS-I+引物(25nmol/L)各1. 0 μ L3种原虫的DNA模板各2. OyLddH20加...
【专利技术属性】
技术研发人员：李国清，程家林，岳彩玲，高振永，刘霞，朱海波，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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