【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种可诱导辅助型t细胞17剔除小鼠模型的构建方法及其剔除效果的验证。
技术介绍
1、辅助性t细胞17(th17细胞)，又称为炎症性th细胞，是一种能分泌白介素17(il-17)的t细胞亚群,属于辅助型cd4+t细胞亚群，主要是由原始cd4+t细胞(cd4+t细胞)在il-6、tgf-β、il21、il-1β等细胞因子作用下诱导分化形成，th17细胞主要参与宿主免疫防御、炎症性和免疫调控。近年来，在多种自身免疫疾病如炎症性肠炎(ibds)、系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)及银屑病(psoriasis)等疾病治疗研究中发现，th17细胞在参与机体免疫反应中发挥重要作用，通过自分泌前炎症细胞因子il-17促进其他多种炎性因子或趋化因子分泌或表达，从而促进机体免疫调节异常。
2、在体内特异性的剔除某一类细胞，是研究该细胞在体内功能的一种有效方法。为了更好的研究th17细胞在免疫系统中的重要作用，研究人员开发了多种th17细胞缺陷小鼠模型，如将维甲酸相关孤核受体(rorc)基因敲除获得的rorc基因敲除模型，rorc基因的缺失可以阻碍th细胞稳态及分化进程。
3、维甲酸相关孤核受体(rorc)，又称为rorγt,或rorγ2,属于核受体超家族成员，在分化成熟的th17细胞上表达。作为th17细胞分化的关键转录因子，rorc具有促进th17细胞分化和功能调节的作用。rorc基因的缺失使得th17细胞正常功能受到严重影响。然而除了rorc基因外，另一种ror家族转录因子ror
4、白喉毒素(dt)是感染β棒状噬菌体的白喉杆菌产生的一种外毒素，由二硫键连接的两个亚基a、b片段组成。dt通过b亚基与其受体肝素结合表皮样生长因子前体(dtr)结合，继而通过细胞粘附和内吞作用进入胞内，通过a亚基具有的adp核糖基转移酶活性抑制翻译延伸因子2(ef2)功能，从而终止蛋白质翻译，导致细胞凋亡。因人类dtr与dt亲和力较高，而小鼠dtr与dt亲和力低，因此人细胞对dt杀伤比小鼠细胞更加敏感。通过将人dtr插入到小鼠基因组特定位点，可提高表达该dtr的特定细胞对dt杀伤的敏感性。
技术实现思路
1、为了深入研究th17细胞的功能，本专利技术利用基因编辑技术在rorc基因的终止密码子处插入人dtr表达片段，通过dt给药的方式剔除dtr表达的th17细胞，从而实现th17细胞的可诱导剔除。
2、本专利技术第一个方面公开可诱导辅助性t细胞17剔除小鼠模型，将白喉毒素受体表达片段构建入维甲酸相关孤核受体基因中进行表达，实现在t细胞中表达白喉毒素受体。
3、本专利技术第二个方面公开了上述可诱导辅助性t细胞17剔除小鼠模型的构建方法，所述构建方法具体包括以下步骤：
4、a.grna靶位点筛选：筛选得到低脱靶风险的grna靶位点，所述grna靶位点的序列信息如seq id no:1所示；
5、grna靶序列决定了诱导cas9切割目的基因的效率和潜在脱靶活性，高效特异的靶序列选择和设计是成功构建rorc-dtr小鼠模型的前提。根据重组方案，对插入位点附近的潜在grna位点进行软件分析，从中优先选择脱靶风险低的位点为后续小鼠受精卵注射实验的grna靶位点(seq id no:1)。
6、b.同源重组载体构建，确定grna位点及插入位点信息，构建同源重组载体；
7、ⅰ.构建基因敲入片段：通过基因合成t2a肽、红色荧光蛋白、p2a肽和白喉毒素受体，其序列信息依次如seq id no:3-5所示，并按照从左到右依次连接构建得到基因敲入片段；
8、ⅱ.构建重组左臂和重组右臂：以小鼠基因组为模板，通过pcr扩增得到重组左臂的序列如seq id no:2所示，重组右臂的序列如seq id no:7所示；
9、ⅲ.构建pbr322-rorc-dtr重组载体：将重组左臂、基因敲入片段和重组右臂连入pbr322载体，获得pbr322-rorc-dtr重组载体；
10、c.rorc-dtr基因敲入小鼠构建：
11、取成熟小鼠的受精卵，将pbr322-rorc-dtr重组载体、cas9 mrna和grna混合后，受精卵显微注射，注射后的受精卵经培养箱短暂培养后，移植至受体母鼠的输卵管，获得基因修饰小鼠f0代小鼠；
12、选取构建成功f0代小鼠与野生型小鼠交配，获得f1代小鼠，鉴定得到重组阳性小鼠。
13、利用引物对对小鼠f0代小鼠和f1代小鼠中重组左臂和重组右臂进行pcr鉴定。
14、所述引物对包括重组左臂的鉴定引物对：引物p1，其序列如seq id no:8所示，和引物p2，其序列如seq id no:9所示；以及重组右臂的鉴定引物对：引物p3，其序列如seq idno:10所示，和引物p4，其序列如seq id no:11所示。
15、 引物名称 序列信息(5’→3’) p1 gccgggagcaagagaaacaagaat(seq id no:8) p2 cacccgagctgcctgagaagaca(seq id no:9) p3 aggcaacttaaggggctggtgag(seq id no:10) p4 ggcgctttcccctgtatttatgag(seq id no:11)
16、本专利技术第三个方面公开了上述的可诱导性小胶质细胞剔除小鼠模型在评价辅助性t细胞17功能中的应用。具体包括在筛选预防和/或治疗炎症药物中的应用。
17、与现有技术相比，本专利技术有如下优势：
18、本专利技术提供一种可诱导辅助型t细胞17剔除小鼠模型的构建方法及其剔除效果的验证。该方法利用rorc分子是促进th17细胞正常分化的关键分子这一特性，通过将白喉毒素受体和红色荧光蛋白tdtomato定点插入rorc分子基因表达框，构建了rorc-t2a-tdtomato-p2a-dtr(简称：rorc-dtr)基因修饰小鼠模型，该模型可以实现小鼠内源rorc基因驱动红色荧光蛋白和白喉毒素受体表达。利用该模型，可以通过tdtoma本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可诱导辅助性T细胞17剔除小鼠模型，其特征在于，将白喉毒素受体表达片段构建入维甲酸相关孤核受体基因中进行表达，实现在T细胞中表达白喉毒素受体。
2.如权利要求1所述可诱导辅助性T细胞17剔除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，利用引物对对小鼠F0代小鼠和F1代小鼠中重组左臂和重组右臂进行PCR鉴定。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述引物对包括重组左臂的鉴定引物对：引物P1，其序列如SEQ ID NO:8所示，和引物P2，其序列如SEQ ID NO:9所示；以及重组右臂的鉴定引物对：引物P3，其序列如SEQ ID NO:10所示，和引物P4，其序列如SEQ ID NO:11所示。
5.如权利要求1所述的可诱导辅助性T细胞17剔除小鼠模型在评价辅助性T细胞17功能中的应用。
6.如权利要求1所述的可诱导辅助性T细胞17剔除小鼠模型在筛选预防和/或治疗炎症药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种可诱导辅助性t细胞17剔除小鼠模型，其特征在于，将白喉毒素受体表达片段构建入维甲酸相关孤核受体基因中进行表达，实现在t细胞中表达白喉毒素受体。
2.如权利要求1所述可诱导辅助性t细胞17剔除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，利用引物对对小鼠f0代小鼠和f1代小鼠中重组左臂和重组右臂进行pcr鉴定。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈如凌，郭洋，范春，朱梦妍，喻智澜，王成稷，
申请(专利权)人：上海实验动物研究中心，
类型：发明
国别省市：
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