【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学生物检测，涉及中枢神经系统感染病原菌的快速检测，具体涉及同时检测多种中枢神经系统感染病原菌的多重荧光探针引物及试剂盒。
技术介绍
1、中枢神经系统感染(central nervous system infections，cnsis)，是指各种病原微生物侵犯中枢神经系统实质、被膜或血管等引起急性或慢性炎症(或非炎症)性疾病。病原微生物包括但不限于病毒、细菌、真菌、螺旋体、寄生虫、立克次体、朊蛋白等。根据感染的部位可分为：(1)脑炎、脊髓炎或脑脊髓炎其主要侵犯脑和(或)脊髓实质；(2)脑膜炎、脊膜炎或脑脊膜炎：主要侵犯脑和(或)脊髓软膜；(3)脑膜脑炎：脑实质与脑膜合并受累，根据发病情况及病程可分为急性、亚急性和慢性感染。中枢神经系统感染的症状可以是多种多样的，取决于感染的部位和严重程度。一些常见的症状包括发热、头痛、呕吐、失眠、幻觉、昏迷等。这些症状可能会影响患者的行动能力、认知功能和感官能力，严重的中枢神经系统感染可能会导致死亡。
2、根据致病病原体的类型一般也可分为病毒性脑(膜)炎、细菌性脑(膜)炎、真菌性脑(膜)炎等。其中，真菌性脑(膜)炎较为罕见；细菌性脑炎脑膜炎较病毒性脑(膜)炎的发病更为危急，且预后更差，是儿童感染性疾病中病死率较高的疾病之一。细菌性脑(膜)炎幸存者中30％～50％遗留永久性神经系统后遗症。因此早期干预可以减轻病情，降低并发症的风险，所以对于疑似中枢神经系统感染的患者，医疗保健专业人员通常会采取紧急措施，如脑脊液检测、预防性使用抗生素、经验性用药等。
3、传统脑
4、此外，多数诊断技术中均未将脑脊液培养阳性率最高的凝固酶阴性葡萄球菌纳入检测范围。凝固酶阴性葡萄球菌(cons)是脑脊液样本培养最多阳性的病原菌，它是不产生血浆凝固酶的一部分葡萄球菌。血浆凝固酶是葡萄球菌的一种毒力因子、是能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质，所以凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。过去认为cons不致病，是普遍存在于健康人皮肤、口腔及肠道的正常菌，但近年来的临床和实验检测结果证实它已成为医源性感染的常见病原菌，尤其是耐药菌株的出现。由于其广泛存在于环境和定植人皮肤等部位，容易通过创口感染，如在颅脑损伤、颅脑手术后及腰椎穿刺时造成感染。
5、脑脊液是无菌部位体液且无定植菌，但经皮穿刺采集脑脊液时，定植与表皮的cons仍可能污染脑脊液标本；有中枢引流管时导管流出的脑脊液可能会有定植菌污染，因此需要严格无菌操作，并根据检测结果和临床情况分别是否为cons污染。由于凝固酶阴性葡萄菌种类较多，且和凝固酶阳性葡萄菌同属葡萄球菌在基因序列上有高度的同源性，因此如何能够通过荧光pcr法准确区分二者也是一个公认的难点，将其与其他常见脑脊液病原菌同时实现检测也未见相关报道。
技术实现思路
1、本专利技术为解决上述技术问题进行，针对社区获得性最常见的单核细胞增多性李斯特菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、脑膜炎奈瑟菌和医院获得性常见的凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌，共9种致病菌的特异保守序列分别设计扩增引物及不同荧光标记taqman荧光探针。同时另外加入了人源性的内参参照，作为试剂盒的内部质控，能够单管分辨3种目的靶标及内源性内参基因。
2、经过大量基因序列的分析与比对，本专利技术成功设计出一套针对脑脊液中的凝固酶阴性葡萄球菌的引物探针，能够将表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌等凝固酶阴性葡萄球菌有效检出，并能与凝固酶阳性葡萄球菌如金黄色葡萄球菌、海豚葡萄球菌、猪葡萄球菌等有效区分。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用的具体技术方案如下：
4、本专利技术第一方面，提供了一种检测凝固酶阴性葡萄球菌的探针引物组合物，其上下游引物序列分别如seq id no.19和20所示，探针序列如seq id no.21所示。
5、本专利技术第二方面，提供了一种针对中枢神经系统感染的多种致病菌的探针引物组合物：(1)检测脑膜炎奈瑟菌的上下游引物序列分别如seq id no.1和2所示，探针序列如seq id no.3所示；(2)检测流感嗜血杆菌的上下游引物序列分别如seq id no.4和5所示，探针序列如seq id no.6所示；(3)检测无乳链球菌的上下游引物序列分别如seq id no.7和8所示，探针序列如seq id no.9所示；(4)检测单核增多李斯特菌的上下游引物序列分别如seq id no.10和11所示，探针序列如seq id no.12所示；(5)检测金黄色葡萄球菌的上下游引物序列分别如seq id no.13和14所示，探针序列如seq id no.15所示；(6)检测肺炎链球菌的上下游引物序列分别如seq id no.16和17所示，探针序列如seq id no.18所示；(7)检测凝固酶阴性葡萄球菌的上下游引物序列分别如seq id no.19和20所示，探针序列如seq id no.21所示；(8)检测肺炎克雷伯菌的上下游引物序列分别如seq id no.22和23所示，探针序列如seq id no.24所示；(9)检测鲍曼不动杆菌的上下游引物序列分别如seq idno.25和26所示，探针序列如seq id no.27所示。具体序列参见表1。
6、优选的，本专利技术提供的针对中枢神经系统感染的多种致病菌的探针引物组合物还包括内参通用引物和探针：内参通用上、下游引物序列分别如seq id no.28和29所示，内参通用探针序列如seq id no.30所示。具体序列参见表1。
7、表1病原菌及内参上游引物、下游引物以及探针序列汇总
8、
9、
10、本专利技术第三方面，提供了一种针对中枢神经系统感染的多种致病菌的多重荧光pcr试剂盒，包括pcr反应液、检测液、阳性质控品以及阴性质控品。检测液中含有上述所述的探针引物组合物。
11、其中，pcr反应液包括pcr buffer、dntp、dutp、mg2+、udg酶和taq热启动酶；
12、检测液共三支，每支包含检测三种病原菌的探针引物组合物以及内参通用引物和探针；将上述病原菌随机分成三组，每组对应一支检测液。每支检测液中，四种探针分别采用不同的荧光基团进行标记。如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测凝固酶阴性葡萄球菌的探针引物组合物，其特征在于，上下游引物序列分别如SEQ ID NO.19和20所示，探针序列如SEQ ID NO.21所示。
2.根据权利要求1所述的检测凝固酶阴性葡萄球菌的探针引物组合物，其特征在于，所述凝固酶阴性葡萄球菌包括表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌。
3.一种针对中枢神经系统感染的多种致病菌的探针引物组合物，其特征在于，
4.根据权利要求3所述的针对中枢神经系统感染的多种致病菌的探针引物组合物，其特征在于，还包括内参通用引物和探针，
5.一种针对中枢神经系统感染的多种致病菌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、检测液、阳性质控品以及阴性质控品，所述检测液中含有权利要求3和4中的探针引物组合物。
6.根据权利要求5所述的针对中枢神经系统感染的多种致病菌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：
7.根据权利要求6所述的针对中枢神经系统感染的多种致病菌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：
8.根据权利要求6所述的针对
9.根据权利要求6所述的针对中枢神经系统感染的多种致病菌的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种检测凝固酶阴性葡萄球菌的探针引物组合物，其特征在于，上下游引物序列分别如seq id no.19和20所示，探针序列如seq id no.21所示。
2.根据权利要求1所述的检测凝固酶阴性葡萄球菌的探针引物组合物，其特征在于，所述凝固酶阴性葡萄球菌包括表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌。
3.一种针对中枢神经系统感染的多种致病菌的探针引物组合物，其特征在于，
4.根据权利要求3所述的针对中枢神经系统感染的多种致病菌的探针引物组合物，其特征在于，还包括内参通用引物和探针，
5.一种针对中枢神经...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑冉，申晓平，曹金良，张瑞，
申请(专利权)人：江苏阔然生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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