一种评估肿瘤内三级淋巴结构的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术提供了一种评估肿瘤内三级淋巴结构的试剂盒及其方法。所述试剂盒包括：非特异性蛋白阻断剂、一抗、二抗和荧光染料，所述非特异性蛋白阻断剂为牛血清白蛋白，所述一抗包括五种标记物。本发明专利技术实施例提供的试剂盒根据高效价对应低强度信号染料以及各染料间补偿最少的原则，完成对抗体与荧光染料的最优匹配。利用本发明专利技术实施例提供了试剂盒评估肿瘤内三级淋巴结构能够在一张组织切片的玻片上实现多重荧光的免疫组化染色，可以同时对多种靶点分子进行标记，能够避免浪费宝贵的临床肿瘤样本，节省了样本，同时还能分析在在同一张切片玻片内各个靶点在空间上的关系。玻片内各个靶点在空间上的关系。玻片内各个靶点在空间上的关系。

【技术实现步骤摘要】
一种评估肿瘤内三级淋巴结构的试剂盒及其方法


[0001]本专利技术涉及生物学检测领域，更具体地，涉及评估肿瘤内三级淋巴结构的试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]目前，已经有多种抗PD
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L1/PD
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1的药物被获批用于实体瘤的治疗，但大多数用药患者并没有从中获益。三级淋巴结构(Tertiary lymphoid structures，TLS)是指在非淋巴组织中发现的类淋巴结构。TLS多见于多种处于发炎状态的组织中，可驱动免疫细胞活化，其形成与慢性炎性疾病、自身免疫病和癌症等多种慢性疾病有关。在肿瘤环境中，TLS可促进免疫细胞浸入实体瘤，因而TLS的发展与未经治疗的患者的生存率显著相关。这使得三级淋巴结构是有效预测免疫检查点抑制剂疗效的生物标志物。
[0003]目前临床常用的评估三级淋巴结构的技术为免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)技术，利用抗原抗体反应原理对肿瘤组织进行染色，由专业病理医生在显微镜下对多张切片的染色进行分析，该技术需耗费较多的肿瘤组织切片，获得的信息较为粗糙，对判读者的要求较高，且不能反应各类细胞在空间上的关系。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种评估肿瘤内三级淋巴结构的试剂盒及其方法，能够在一张组织切片的玻片上实现多重荧光的免疫组化染色，可以同时对多种靶点分子进行标记，能够避免浪费宝贵的临床肿瘤样本，节省了样本。
[0005]一方面，本专利技术实施例提供了一种评估肿瘤内三级淋巴结构的试剂盒，所述试剂盒包括：非特异性蛋白阻断剂、一抗、二抗和荧光染料，
[0006]所述非特异性蛋白阻断剂为牛血清白蛋白，所述一抗包括五种标记物，所述五种标记物分别为：标记物CD8、标记物CD20、标记物CD23、标记物PANCK和标记物PDL1，所述二抗包括辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，所述荧光染料包括：与所述标记物CD8相配合的荧光染料PPD480、与所述标记物CD20相配合的荧光染料PPD520、与所述标记物CD23相配合的荧光染料PPD570、与所述标记物PANCK相配合的荧光染料PPD620和与所述标记物PDL1相配合的荧光染料PPD690，所述二抗为与所述荧光染料相配合的二抗工作液。
[0007]具体地，所述试剂盒还包括抗原修复液，所述抗原修复液包括免疫组化抗原修复液。
[0008]具体地，所述试剂盒还包括抗原修复液，所述抗原修复液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液或乙二胺四乙酸缓冲液。
[0009]具体地，所述试剂盒还包括加固液，所述加固液为浓度为10％的中性福尔马林溶液。
[0010]具体地，所述试剂盒还包括水化剂，所述水化剂为包括浓度分别为100％、95％和75％的乙醇。
[0011]具体地，所述标记物CD8的稀释倍数为200倍，所述标记物CD20的稀释倍数为400倍，所述标记物CD23的稀释倍数为1000倍，所述标记物PANCK的稀释倍数为400倍，所述标记物PDL1的稀释倍数为250倍。
[0012]具体地，所述试剂盒还包括：缓冲液、4',6
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二脒基
‑2‑
苯基吲哚(4',6
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diamidino
‑2‑
Phenylindole，DAPI)工作液、封片剂、脱蜡剂和灭菌去离子水。
[0013]另一方面，本专利技术实施例提供了一种采用上述试剂盒评估肿瘤内三级淋巴结构的方法，所述方法包括：
[0014]步骤1：将带有标本的玻片进行脱蜡和水化处理，得到预处理玻片；
[0015]步骤2：将所述预处理标本进行加固，得到加固玻片；
[0016]步骤3：高温煮沸抗原修复液后，向所述抗原修复液中加入所述加固玻片并低温加热10分钟，得到修复后的玻片；
[0017]步骤4：将所述修复后的玻片用灭菌去离子水清洗1次，再用缓冲液冲洗1次，去除多余的水分，用组化笔圈画出组织，并滴加所述非特异性蛋白阻断剂，室温保湿并振荡孵育10分钟，并弃去所述非特异性蛋白阻断剂；
[0018]步骤5：滴加稀释后的所述一抗中的一种标记物，于室温保湿振荡孵育30～60min，用缓冲液冲洗3次，每次2分钟；
[0019]步骤6：弃去所述缓冲液，滴加所述二抗，于室温保湿震荡孵育10分钟，用所述缓冲液冲洗3次，每次2分钟，弃去所述缓冲液；
[0020]步骤7：滴加所述荧光染料中与所述一种标记物相配合的荧光染料，于室温保湿震荡孵育10分钟，用所述缓冲液冲洗2分钟，得到第一次染色的玻片；
[0021]步骤8：将所述抗原修复液煮沸1min，放入所述第一次染色的玻片于低温加热10分钟，取出自然冷却至室温；
[0022]步骤9：重复四次步骤5～8，使所述五种标记物分别进行标记。
[0023]步骤10：滴加4',6
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二脒基
‑2‑
苯基吲哚工作液并于室温保湿孵育10min，用缓冲液清洗后滴加封片剂进行封片处理；
[0024]步骤11：评估肿瘤内三级淋巴结构。
[0025]具体地，使用成像显微镜采集光谱图像和分析软件对所述肿瘤内三级淋巴结构进行评估。
[0026]具体地，所述标记物CD8稀释200倍，所述标记物CD20稀释400倍，所述标记物CD23稀释1000倍，所述标记物PANCK稀释400倍，所述标记物PDL1稀释250倍。
[0027]具体地，所述五种标记物按照所述标记物CD23、所述标记物CD20、所述标记物PANCK、所述标记物PDL1和所述标记物CD8的顺序依次分别进行标记。
[0028]具体地，在本实施例中低温均指的是低功率加热，使其温度保持在98℃～100℃之间。
[0029]具体地，所述评估肿瘤内三级淋巴结构的方法包括：采用每种所述标记物各自对应的荧光通道进行检测，并使用成像显微镜采集荧光光谱图像和分析软件对所述肿瘤内三级淋巴结构进行评估，所述标记物CD8对应480nm荧光通道，所述标记物CD20对应570nm荧光通道，所述标记物CD23对应620nm荧光通道，所述标记物PANCK对应690nm荧光通道，所述标记物PDL1对应520nm荧光通道。
[0030]本专利技术实施例提供的试剂盒根据高效价对应低强度信号染料以及各染料间补偿最少的原则，完成对抗体与荧光染料的最优匹配。利用本专利技术实施例提供了试剂盒评估肿瘤内三级淋巴结构能够在一张组织切片的玻片上实现多重荧光的免疫组化染色，可以同时对多种靶点分子进行标记，能够避免浪费宝贵的临床肿瘤样本，节省了样本，同时还能分析在在同一张切片玻片内各个靶点在空间上的关系。
[0031]本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
[0032]附图用来提供对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评估肿瘤内三级淋巴结构的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：非特异性蛋白阻断剂、一抗、二抗和荧光染料，所述非特异性蛋白阻断剂为牛血清白蛋白，所述一抗包括五种标记物，所述五种标记物分别为：标记物CD8、标记物CD20、标记物CD23、标记物PANCK和标记物PDL1，所述二抗包括辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，所述荧光染料包括：与所述标记物CD8相配合的荧光染料PPD480、与所述标记物CD20相配合的荧光染料PPD520、与所述标记物CD23相配合的荧光染料PPD570、与所述标记物PANCK相配合的荧光染料PPD620和与所述标记物PDL1相配合的荧光染料PPD690，所述二抗为与所述荧光染料相配合的二抗工作液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗原修复液，所述抗原修复液包括免疫组化抗原修复液。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗原修复液，所述抗原修复液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液或乙二胺四乙酸缓冲液。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括加固液，所述加固液为浓度为10％的中性福尔马林溶液。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物CD8的稀释倍数为200倍，所述标记物CD20的稀释倍数为400倍，所述标记物CD23的稀释倍数为1000倍，所述标记物PANCK的稀释倍数为400倍，所述标记物PDL1的稀释倍数为250倍。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液、水化剂、4',6
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二脒基
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苯基吲哚工作液、封片剂、脱蜡剂和灭菌去离子水。7.一种采用权利要求1所述的试剂盒评估肿瘤内三级淋巴结构的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1：将带有标本的玻片进行脱蜡和水化处理，得到预处理玻片；步骤2：将所述预处理标本进行加固，得到加固玻片；步骤3：高温煮沸抗原修复液后，向所述抗原修复液中加入所述加固玻片并低温加热10分钟，得到修复后的玻片；步骤4：...

【专利技术属性】
技术研发人员：管小松，林学妮，
申请(专利权)人：江苏阔然生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：