一种与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物、抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种与肺癌相关的血浆外泌体标志物及其应用。该标志物为血浆外泌体蛋白TLR7。本发明专利技术筛选出的血浆外泌体蛋白TLR7对肺癌病人检测的特异性和灵敏度较高，可以大大提高肺癌诊断的准确性。该标志物可用于制备诊断试剂盒，用于肺癌的辅助早期诊断。早期诊断。早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物、抗体及其应用
专利

[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及一类与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物、两种抗体及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌类型的85%以上，死亡率高达80%～90%。由于缺乏有效的早期诊断筛查方法，70%肺癌患者确诊时已是晚期，5年生存率仅为16%～18%。因此NSCLC 的早期诊断尤其重要。目前，NSCLC临床早筛主要基于经典的血液肿瘤标志物——癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、低剂量计算机断层扫描（Low
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dose computerized tomography，LDCT）以及纤维支气管内窥镜等检查。但是，这些检测手段具有低敏感性或有创性等局限，因此，基于液体活检开发无创和敏感的筛查是NSCLC 早诊的重大挑战。
[0003]外泌体（Exosomes）是纳米级别的细胞外囊泡，其直径介于50
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150 nm，起源于内体系统，存在于包括血液在内的几乎所有体液中。其携带DNA、m RNA、非编码RNA、蛋白质和脂质，它能够借由脂质双层膜结构，保护其内容物不被降解。所有细胞类型，包括肿瘤细胞，都能够将外泌体释放到细胞外空间，并且癌症患者的外泌体数量显著高于健康人。肿瘤来源的外泌体一旦释放后就可以充当前哨，通过与质膜融合或与蛋白质受体相互作用来靶向细胞，进而广泛的参与肿瘤的增殖、转移和逃逸等过程。外泌体可为肺癌的早期诊断提供重要信息，具有成为肺癌肿瘤标志物的潜力。因此，外泌体是癌症领域最有希望的液体活检标记之一。
[0004]研究表明，部分外泌体蛋白在肿瘤患者体内异常表达，具有成为肿瘤诊断标志物的潜力。与常规肿瘤确诊方法相比，外泌体蛋白检测具有取样简便，检测成本低等优势，在肿瘤诊断生物标志物方面具有广阔的开发及应用前景。
[0005]但是，血浆外泌体蛋白在肺癌无创诊断中的应用前景仍有待发掘，如果能筛选到肺癌中异常表达的血浆外泌体蛋白作为生物标志物，并研发相应的诊断试剂盒，对肺癌的诊断现状将会有大大的推动。
[0006]
技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的是针对肺癌临床无创诊断中的问题，提出一类与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物、以及该类血浆外泌体蛋白标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物，所述的血浆外泌体蛋白标志物为血浆外泌体蛋白TLR7。
[0009]进一步的技术方案，所述的血浆外泌体蛋白标志物为血浆外泌体蛋白CD47、CD63、TLR7的组合。
[0010]CD47是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，也称为整联蛋白相关蛋白（IAP），分子量52 kDa。该蛋白具有免疫球蛋白可变的N端结构域、5个跨膜结构域和一个短的C端胞内尾，胞内尾部有四种可变不同剪接异构体，从而形成4个亚型。CD47亚型2主要在造血细胞、血管内皮细胞和上皮细胞中表达，1亚型在角质形成细胞中表达，3和4亚型在神经元细胞、肠粘膜细胞和睾丸细胞中均有表达。
[0011]CD63是一种蛋白质抗原，在人体中由CD63基因编码，CD63主要出现在细胞外囊泡的表面，也会出现在普通的细胞膜表面。
[0012]Toll 样受体（TLR）家族成员针对果蝇中密切相关的 Toll 样受体命名，在天然免疫应答中发挥重要作用。TLR 识别各种病原体中存在的保守基序，并介导防御反应。触发 TLR 通路导致 NF
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κB 激活及对免疫基因和炎症基因的后续调控。
[0013]本专利技术提供了一种抗体，所述抗体能特异性捕获包括上述的与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物。该抗体是由Abcam公司定制合成的抗TLR7蛋白的单克隆抗体和生物素化的抗TLR7蛋白抗体；进一步的，该抗体是由Abcam公司定制合成的抗CD47、CD63、TLR7蛋白的单克隆抗体和生物素化的抗CD47、CD63、TLR7蛋白抗体。
[0014]本专利技术提供了上述的血浆外泌体蛋白标志物、抗体在肺癌诊断试剂盒制备中的应用。
[0015]本专利技术提供了一种肺癌诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中的上述的蛋白标志物的表达量。
[0016]进一步的技术方案，所述的试剂盒中包括上述的抗体。
[0017]进一步的技术方案，所述的试剂盒还包括酶联免疫常用的试剂和酶。
[0018]进一步的技术方案，所述的试剂盒包括抗TLR7蛋白的单克隆抗体、 TLR7标准品、生物素化的抗TLR7蛋白抗体、辣根过氧化物标记的亲和素、生物素。
[0019]进一步的技术方案，所述的试剂盒包括抗CD47、CD63、TLR7蛋白的单克隆抗体，CD47、CD63、TLR7标准品，生物素化的抗CD47、CD63、TLR7蛋白抗体，辣根过氧化物标记的亲和素，生物素。
[0020]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的血浆外泌体蛋白标志物作为肺癌诊断的标志物的优势在于：(1) 传统肺癌的血浆标志物主要是以癌胚抗原(CEA)为代表的蛋白类生物标志物，存在灵敏性和特异性不高的缺点，而血浆外泌体TLR7蛋白是一种新型生物标志物，在肺癌病人血浆中特异表达且表达稳定，易于检测、定量。通过本专利技术提供的TLR7蛋白，或CD47、CD63、TLR7蛋白组合进行肺癌血浆无创诊断，有利于对目前肺癌进行辅助诊断，将大大提高肺癌无创诊断的敏感性和特异性。
[0021](2) 本专利技术系统的通过外泌体蛋白质谱分析及Western blot方法研究了血浆外泌体蛋白在肺癌患者血浆外泌体中的差异表达，进一步验证其在肺癌诊断中的应用价值。
[0022]（3）本专利技术通过ELISA对大样本进行了多阶段验证，采用了绝对定量进行验证：血浆外泌体TLR7、CD47、CD63蛋白组合使用与相较于血浆外泌体TLR7单一使用，敏感度和特异性均有明显提高；保证了肺癌血浆外泌体CD47、CD63、TLR7蛋白生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
[0023]附图说明
[0024]图1（a）为血浆外泌体形态图；图1（b）为血浆外泌体粒径图；图1（c）为血浆外泌体表面标志蛋白图；图2为肺癌病人组与健康对照组血浆中表达差异最显著的21种蛋白质的质谱分析热图。
[0025]图3为3种筛选出的显著差异蛋白（CD63、PRSS1、CD47、TLR7）在肺癌病人组与健康对照组血浆外泌体中表达差异的Western blot结果图。
[0026]图4为蛋白质CD47、CD63、TLR7在肺癌病人组与健康对照组血浆外泌体中的差异表达的ELISA结果图。
[0027]图5为TLR7对肺癌病人诊断效果的ROC图；图6为CD47、CD63、TLR7组合使用、与TLR7单一使用、CEA蛋白质分别对肺癌病人诊断效果的ROC图。
具体实施方式
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物，其特征在于：所述的血浆外泌体蛋白标志物为血浆外泌体蛋白TLR7。2.根据权利要求1所述的与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物，其特征在于：所述的血浆外泌体蛋白标志物为血浆外泌体蛋白CD47、CD63、TLR7的组合。3.一种抗体，其特征在于，所述抗体能特异性捕获包括权利要求1或权利要求2所述的肺癌血浆外泌体蛋白标志物。4. 权利要求1或权利要求2 所述的血浆外泌体蛋白标志物在肺癌诊断试剂盒制备中的应用。5. 权利要求3 所述的抗体在肺癌诊断试剂盒制备中的应用。6.一种肺癌诊断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测血浆中的如权利要求1或权利要求2所述的外泌体蛋白标...

【专利技术属性】
技术研发人员：王延博，梁高丽，徐学博，张子璇，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：