本发明专利技术公开了一种酶法制备光学活性茶氨酸的方法。该方法包括下列步骤：采用氰酸盐和谷氨酸为原料，在碱性条件下进行反应，酸化成环后形成羧乙基海因；然后采用接肽试剂将羧乙基海因末端羧基接上乙胺，经萃取、浓缩结晶分离，可获得Ｎ－乙基海因丙酰胺；以含有海因酶和氨甲酰酶的湿菌体为催化剂，在弱碱性条件下，催化水解Ｎ－乙基海因丙酰胺制备Ｌ或Ｄ－茶氨酸；将所得茶氨酸酶转化溶液经分离，浓缩，结晶得Ｌ或Ｄ－茶氨酸。本发明专利技术方法采用海因环共保护了谷氨酸中的α－氨基和羧基，仅暴露出γ－羧基，保证了接乙胺反应的位置专一性。本发明专利技术方法避免了多数化学合成中的反复的保护与脱保护步骤，操作简单，减少了副反应的发生。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种采用海因酶法制备D或L-茶氨酸的方法。
技术介绍
L-茶氨酸是茶叶中所含的一种特殊氨基酸，结构与谷氨酸类似，属于y-谷氨酰乙胺 衍生物。L-茶氨酸在茶叶中的平均含量为1~2%，占茶叶氨基酸总量的50%以上。L-茶 氨酸能明显促进大脑中枢神经系统释放出多巴胺并提高多巴胺的生理活性，从而有助于 放松身体、缓解疲劳、有效控制抑郁症症状(彭滢等，CN03124680,X)。国内外保健品 厂商已开发上市了多种以L-茶氨酸为主的制备治疗和/或抑郁症的药物和/或保健品(陈 建操等，CN200510200423.9);制备治疗和/或预防中风后遗症或中风恢复期的药物和/ 或保健品(陈建操，CN200510200657.3);化妆或治疗组合制剂，用于改善皮肤湿度、 皮肤弹性和/或减少皮肤皱纹(&布鲁蒙等，CN200610084116.3);含有茶氨酸和咖啡因 的用于提高精神警觉性的食品或饮料制品(G'N'欧文等，CN200580042368.3)。国际上 将L-茶氨酸定为GRAS (即公认为安全)物质，美、日等国卫生主管部门均将茶氨酸的 允许摄入量定为成人每次200 300mg,每日l-2次均可。D-茶氨酸作为一种手性原料， 在有机合成中也有相应的用途。目前，L-茶氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、植物细胞培养法和酶法。 提取法主要是从低档茶叶、茶末、茶梗以及茶多酚提取工业废料中提取，来源广泛但需 要大量的溶剂、步骤烦琐、产量小、成本高(株式会社伊藤园，ZL200310100097.5;陈 波等，ZL03118181.3;林智等，ZL200310109053.9;江和源等，CN200410015905.2;阎 卫东等，ZL200410052980.6;张守政，CN200610055145.7;王洪新等，CN 200710020258.8; 范小兵等，CN200610025794.2)。化学合成法多采用L-谷氨酸为原料，通过保护氨基， 活化Y-羧基，再与乙胺反应制备具有保护基团的茶氨酸，再进一步脱去保护基生成茶氨 酸或是形成L-吡咯烷酮酸和乙胺反应制备(李炎等，ZL200310117502.4;焦庆才等， ZL200410014081.7;陈新等，ZL200410033794.8;郑国斌，ZL200410041298.7;陈新 等，CN200610092083.7;李炎等，ZL02134857.X);也有制备酰化DL-茶氨酸后进行酶 法拆分的过程(朱廷哲等，CN200510122360.X)。化学合成的优点是费时少、操作相 对简单、可大量合成。但其缺点是提纯不易，且易混杂有毒物质，产品不宜用于食品卫 生行业。植物细胞培养法采用茶树愈伤组织或悬浮细胞培养来合成茶氨酸，悬浮细胞与 愈伤组织相比生长迅速，相对产量较高，细胞分离与产物提取比较容易。但悬浮细胞合成的茶氨酸向培养基中的释放水平太低，在植物细胞培养结束后，仍需要通过提取方式 从细胞中获得，这与从茶叶中提取具有同样的缺点(华萍等，云南植物研究，2006. 28(2): 215 218;广西植物，27(3): 457-461)。可以用于合成茶氨酸的酶有两种茶氨酸合 成酶和？谷氨酰基转肽酶(冈田幸隆等，CN200580021833.5 ; 立木隆等， CN03821300.1;王贤波等，茶叶科学，2007, 27 (1) : 61~66)。但前者制备过程需要 能量产物ATP，在进行催化乙胺和谷氨酸合成茶氨酸的同时，要构建ATP再生系统；而 后者虽不需要消耗ATP，却容易产生水解、转肽等多种副反应。D-茶氨酸的制备方法目 前尚无报道。因此，开发一种新的、简便的、易于工业化规模制备L或D-茶氨酸(1)的新方法 对于茶氨酸的工业化制备具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种简便的、易于工业化规模生产的酶法制备光 学活性茶氨酸的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下 ，包括下列步骤(1)谷氨酸制备羧乙基海因。 以氰酸盐和谷氨酸为原料，氰酸盐与谷氨酸的摩尔比为1~1.4:1，在碱性条件下进行反应，酸化成环后形成羧乙基海因，实现对谷氨酸a-羧基和氨基共保护。其中，所述的谷氨酸为L-谷氨酸、DL-谷氨酸、D-谷氨酸和谷氨酸一氢钠中的任意 一种。所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。所述的碱性条件下反应条件为pH8.5~10.0、 50~80 'C、搅拌反应1~5 h，调碱所适用的碱可以是氢氧化钠或是氢氧化钾。所述的酸 化成环反应条件为pH1 2.5， 90-120 'C、搅拌反应0.2~3 h，调酸所适用的酸为有机酸 如甲酸、乙酸，或无机酸如盐酸、硫酸、磷酸，优选盐酸或硫酸，可以是稀盐酸或稀硫1, NaCNO， KO'H ， 2， H2S。4 O^酸，也可以是浓盐酸或浓硫酸。(2) 羧乙基海因与乙胺反应制备N-乙基海因丙酰胺。在DMF中，采用接肽试剂将羧乙基海因末端羧基接上乙胺，接肽试剂与羧乙基海 因的摩尔比为1 1.4:1，经萃取、浓縮结晶分离，可获得N-乙基海因丙酰胺。.COOH NH DCC, HOBt ,NH2 '4其中，采用接肽试剂在羧乙基海因末端羧基接上乙胺，具体方法即为先将接肽试剂 与羧乙基海因反应l~8h，去除沉淀，取滤液加入乙胺反应10 18h。所述的接肽试剂为 DCC/HOBt (二环己基碳二亚胺/l-羟基-苯并三氮唑)、DIC/HOBt (二异丙基碳二亚胺/l-羟基-苯并三氮唑)、DCC/HOSu (二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)和DCC/HOAt (二环己基碳二亚胺/l-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)中的任意一种。乙胺的加入方式为通入 气体乙胺、或加入乙胺水溶液(如70。/。(w/w)乙胺水溶液)、或加入盐酸乙胺盐固体。(3) N-乙基海因丙酰胺经海因酶水解制备L或D-茶氨酸。以含有羧乙基海因酶和氨甲酰酶的湿菌体为催化剂，在弱碱性条件下，催化水解步 骤(2)得到的N-乙基海因丙酰胺制备具有光学活性的D-茶氨酸或具有光学活性的L-茶氨酸。1， hydantoinase2， N-carbamoylase4其中，所述的含有羧乙基海因酶和氨甲酰酶的湿菌体为芽孢杆菌MH602 (5fld//^ /ord/MH602，中国典型培养物保藏中心保藏，CCTCCNO.M206144),或洋葱伯克霍氏 德氏菌JS-02 (&r狄oWen》c印ec/a JS-02,中国典型培养物保藏中心保藏，CCTCC NO，M202047)。以芽孢杆菌MH602为催化剂可制备得到具有光学活性的L-茶氨酸以洋 葱伯克霍氏德氏菌JS-02为催化剂可以制备得到具有光学活性的D-茶氨酸。所述的弱碱 性条件为pH7.5 9.5，所适用的碱可以是氢氧化钠或是氢氧化钾。湿菌体与N-乙基海因 丙酰胺的重量比为1:1~8。催化水解反应温度为3545'C，反应时间10 24小时。(4)将所得D或L-茶氨酸溶液分离，浓縮，结晶。 取酶水解后的反应液，离心除去菌体，然后减压蒸发结晶，无水乙醇重结晶，得具 有光学活性的D-茶氨酸晶体或具有光学活性的L-茶氨酸晶体。 有益效果本专利技术的酶法制备光学活性茶氨酸的方法与其他制备方法相比有如下优点1、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶法制备光学活性茶氨酸的方法，其特征在于该方法包括下列步骤： （１）以氰酸盐和谷氨酸为原料，氰酸盐与谷氨酸的摩尔比为１～１．４∶１，在碱性条件下进行反应，酸化成环后形成羧乙基海因； （２）采用接肽试剂将羧乙基海因末端羧基接上 乙胺，接肽试剂与羧乙基海因的摩尔比为１～１．４∶１，经萃取、浓缩结晶分离，可获得Ｎ－乙基海因丙酰胺； （３）以含有羧乙基海因酶和氨甲酰酶的湿菌体为催化剂，在弱碱性条件下，催化水解步骤（２）得到的Ｎ－乙基海因丙酰胺制备具有光学活性的Ｄ－ 茶氨酸或具有光学活性的Ｌ－茶氨酸； （４）将所得Ｄ或Ｌ－茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶。
【技术特征摘要】
1、一种酶法制备光学活性茶氨酸的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)以氰酸盐和谷氨酸为原料，氰酸盐与谷氨酸的摩尔比为1～1.4∶1，在碱性条件下进行反应，酸化成环后形成羧乙基海因；(2)采用接肽试剂将羧乙基海因末端羧基接上乙胺，接肽试剂与羧乙基海因的摩尔比为1～1.4∶1，经萃取、浓缩结晶分离，可获得N-乙基海因丙酰胺；(3)以含有羧乙基海因酶和氨甲酰酶的湿菌体为催化剂，在弱碱性条件下，催化水解步骤(2)得到的N-乙基海因丙酰胺制备具有光学活性的D-茶氨酸或具有光学活性的L-茶氨酸；(4)将所得D或L-茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶。2、 根据权利要求1所述的酶法制备光学活性茶氨酸的方法，其特征在于步骤(1) 中，所述的谷氨酸为L-谷氨酸、DL-谷氨酸、D-谷氨酸和谷氨酸一氢钠中的任意一种。3、 根据权利要求1所述的酶法制备光学活性茶氨酸的方法，其特征在于步骤(1) 中，所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。4、 根据权利要求1所述的酶法制备光学活性茶氨酸的方法，其特征在于步骤(1) 中，所述的碱性条件为pH8.5~10.0。5、 根据权利要求1所述的酶法制备光学活性茶氨酸的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹飞，韦萍，周佳栋，王月霞，武红丽，黄荣醒，张芙蓉，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84[]
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