【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，特别涉及一种创制耐储藏菠萝新种质的方法。
技术介绍
1、菠萝[ananas comosus(l.)merr]，凤梨科凤梨属多年生单子叶草本果树，是世界著名的热带水果之一。我国菠萝以鲜食为主，加工果只占总产量的10％左右。在我国菠萝集中上市时间与柑橘、荔枝等重叠，容易造成滞销。菠萝成熟以后不耐储存，常温下只能存放7至10天，以后很快软化腐烂。我国每年因为不能及时售卖而软化腐烂丢弃的菠萝占总产量的30％左右。目前菠萝采后保鲜技术有冷藏、控制储藏空气、热水处理、1-甲基环丙烯(1-mcp)处理、矿物油涂抹、钙离子喷施、辐照等，菠萝鲜果国际贸易普遍采用的方法是菠萝果实采摘后，用54度热水浸泡3分钟，放置在13-15度环境中6-8小时，然后放置在7-13度、相对湿度为80-90％、氧气含量为2-5％、二氧化碳含量为5-10％的环境中进行长距离运输。运用该方法菠萝果实采后可以存放14-28天。从中国到美国海运一般需要15-20天，加上包装、运往港口、海关办理通关、超市摆放、销售等因素，从采收到消费者购买，至少需要50天。即使在国内，从海南到哈尔滨货运也需要8天左右，加上包装、超市摆放等因素，从采收到消费者购买，至少需要30天。导致我国菠萝以国内消费为主，出口量很少。2019年，我国菠萝出口量为0.586万吨，仅占当年菠萝总产量的0.34％。为了长距离运输，多数情况七成熟甚至六成熟的时候就采摘，造成菠萝应有的品质发挥不出来，影响菠萝口感。研究菠萝果实采后软化腐烂的原因，培育耐储藏菠萝新品种，是解决这些问题的根本途径
技术实现思路
1、针对现有技术的上述缺陷，本专利技术提出一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案:
3、一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4、(1)引物设计：合成引物p1和p2，或，p3和p4；
5、p1核苷酸序列为:5’-ggcacaccaacggccgccacggcg-3’，
6、p2核苷酸序列为:5’-aaaccgccgtggcggccgttggtg-3’，
7、p3核苷酸序列为:5’-ggcacgctggagttaatacgtgag-3’，
8、p4核苷酸序列为:5’-aaacctcacgtattaactccagcg-3’，
9、所述合成引物的序列中大写字母为载体序列，小写字母为目的基因；
10、(2)中间载体构建：将p1、p2混合或p3、p4混合，变性退火得到pam，将pam直接和aari酶切回收后的sk-grna载体连接，得到重组表达载体；将重组表达载体转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞，划线培养，提取质粒；其中重组表达载体的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示；
11、(3)鉴定：将步骤(2)所得的质粒用载体上的t3引物及反向引物进行测序鉴定，得到测序正确的质粒；
12、(4)构建至最终载体：步骤(3)所述的质粒用限制性内切酶bglii和kpni双酶切切出含有目的片段的grna，pc1300-cas9载体用限制性内切酶kpni和bamhi酶切回收；将带有目的片段的grna和酶切回收的pc1300-cas9载体用t4连接酶直接连接，得到重组载体；将重组表达载体转至大肠杆菌中，划线培养，提取质粒；
13、(5)转化：把步骤(4)所得的质粒转至土壤农杆菌gv3101中，应用土壤农杆菌gv3101对菠萝胚性愈伤组织进行侵染，侵染后的愈伤组织在含有潮霉素的1/2ms培养基上进行培养，将存活下来的愈伤组织分化成苗，运用潮霉素抗性基因hpt ii序列对应引物对这些苗的dna进行pcr扩增，扩增出对应潮霉素基因长度的片段的幼苗，即为耐储藏菠萝新种质。将幼苗培养至25-40片叶，运用电石进行催花，6个月后采摘果实，室温下放置不同天数，检测果实硬度。
14、优选地，步骤(2)中获得pam的具体步骤为：将引物p1、p2、p3和p4分别用水稀释至50μmol/l，分别取上述引物各20μl，将引物p1和p2混合，p3和p4混合，混匀后变性退火，在100℃下变性10min，然后取出冷却至室温，得pam1和pam2；其中合成引物p1和p2混合扩增得到pam1，引物p3和p4混合扩增得到pam2。
15、优选地，步骤(2)和步骤(4)中的划线培养在含100μg/ml kan的lb培养基上划线涂布，37℃恒温培养16-20h；挑取单菌落在37℃，200rpm条件下摇菌7-8h后提取质粒。
16、优选地，步骤(3)t3引物及反向引物的核苷酸序列信息为：
17、t3引物核苷酸序列：5'-aattaaccctcactaaaggga-3'，为seq id no.7；
18、反向引物核苷酸序列：5'-accactttgtacaagaaagctgggt-3'，为seq id no.8；
19、优选地，步骤(5)中所述潮霉素的浓度为20～50mg/l。
20、优选地，步骤(5)中所述潮霉素的浓度为30mg/l。
21、优选地，步骤(5)中所述潮霉素抗性基因hpt ii序列对应引物为：
22、p5：5'-ctatttctttgccctcggacgagtg-3'，为seq id no.9；
23、p6：5'-atgaaaaagcctgaactcaccgcga-3'，为seq id no.10；。
24、优选地，1/2ms培养基成分为:950mg/l硝酸钾、825mg/l硝酸铵、85mg/l磷酸二氢钾、185mg/l硫酸镁、220mg/l氯化钙、0.83mg/l碘化钾、6.2mg/l硼酸、22.30mg/l硫酸锰、8.6mg/l硫酸锌、0.25mg/l硫酸钠、0.025mg/l硫酸铜、0.025mg/l氯化钴、37.3mg/l乙二胺四乙酸二钠、27.8mg/l硫酸亚铁、100mg/l肌醇、2mg/l甘氨酸、0.1mg/l硫酸硫铵素、0.5mg/l盐酸吡哆醇、0.5mg/l烟酸、30000mg/l蔗糖和7000mg/l琼脂。
25、优选地，所述方法在创制耐储藏菠萝新种质中的应用。
26、优选地，所述菠萝的品种为台农16、台农17、金菠萝、巴厘中的任意一种。
27、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:
28、成功将外源基因pam1和pam2构建载体转化至菠萝中，得到耐储藏菠萝新种质。经检测表明，由外源基因pam1和pam2分别与sk-grna载体构建的重组表达载体在不同菠萝品种中得到了不同程度的表达，增加菠萝果实硬度，并成功获得具有目的性状的菠萝新种质，所述重组表达载体的核苷酸序列如seq id no.1所示或如seq id no.2所示。这表明本专利技术建立的菠萝基因转化方法可以用于菠萝基因功能研究及菠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)所述连接为用T4 DNA连接酶连接。
3.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(3)所述鉴定为：将步骤(2)所得的质粒用载体上的T3引物及反向引物进行测序鉴定，得到测序正确的质粒；所述T3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(4)所述质粒用限制性内切酶为BglII和KpnI双酶切；pC1300-Cas9载体用限制性内切酶为KpnI和BamHI双酶切。
5.据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(5)所述的培养基为1/2MS培养基。
6.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(2)中变性退火的条件为：在100℃下变性10min，然后取出冷却至室温。
7.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)中的划线培养为在含100μg/ml Kan的LB培养基上划线涂布，37℃恒温培养16-20h；挑取单菌落在37℃，200rpm条件下摇菌7-8h后提取质粒。
8.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(5)中所述潮霉素的浓度为20～50mg/L。
9.权利要求1～8任一项所述的方法在创制耐储藏菠萝新种质中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述菠萝的品种为台农16、台农17、金菠萝、巴厘中的任意一种。
...【技术特征摘要】
1.一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)所述连接为用t4 dna连接酶连接。
3.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(3)所述鉴定为：将步骤(2)所得的质粒用载体上的t3引物及反向引物进行测序鉴定，得到测序正确的质粒；所述t3引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.8所示。
4.根据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步骤(4)所述质粒用限制性内切酶为bglii和kpni双酶切；pc1300-cas9载体用限制性内切酶为kpni和bamhi双酶切。
5.据权利要求1所述的一种创制耐储藏菠萝新种质的方法，其特征在于，步...
【专利技术属性】
技术研发人员：舒海燕，常胜合，王悠，栾爱萍，贺军虎，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：
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