【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业生物，尤其涉及一种利用红掌‘雪玉’进行花青素合成基因功能快速验证的方法。
技术介绍
1、红掌(anthurium andraeanum linden)又名花烛，为天南星科花烛属多年生草本植物。叶片长圆状心形或卵心形，佛焰苞心形，革质并具有蜡质光泽，色彩丰富，可作为盆花或切花，具有很高的观赏价值，为世界三大热带花卉之一。
2、红掌最独特的部位是它心形的佛焰苞。国际市场对花色各异的红掌品种需求很大。‘雪玉’(植物品种权号：can20090270.0)是红掌“阿拉巴马”的白色芽突变体，代谢组分析几乎没有检测到花青素。花青素合成途径中的关键功能基因在显色过程中起着重要作用，类黄酮3-o-糖基转移酶(ufgt)基因是该途径下游通过葡萄糖苷化促进花青素积累的关键酶。
3、在红色佛焰苞中，花青素主要是花青素苷类和少量的天竺葵苷(iwata et al.，1985)。它们都来自类黄酮合成途径。第一步是由查酮合成酶(chs)催化4-甲酰基辅酶a生成柚皮素查尔酮。随后涉及的酶有chi、f3h、dfr、ans、uf3gt、rt/gt/mt等。形成的中间体包括柚皮苷/二烯二醇、二氢黄酮醇、白花青素、花青素和花青素(vern,2002)。在花青素生物合成途径中，udp-glucose:flavonoid 3-o-glucosyltransferase(uf3gt)是催化花青素3-o-glucosyltransferase的最后一个结构基因。它将不稳定的花青素转化为稳定的花青素。在大多数植物中，花青素的积累与uf3
4、转基因是验证基因功能最直接的方法，但其前提是要建立遗传转化体系，并需要植株再生后观察表型来确定基因功能，难度大，费时费力、周期长。李秀秀(2019)利用红掌茎段为外植体，农杆菌侵染后，诱导出愈伤组织、不定芽；盛慧等(2017)以红掌叶片为外植体，通过愈伤组织诱导、不定芽分化和生根培养，建立了高效再生技术体系；孔周阳(2017)利用红掌叶片为外植体，通过愈伤组织诱导后获得了不定芽；dao thanh luong(2012)也以红掌组培苗的叶片为外植体，农杆菌侵染后，通过愈伤组织、不定芽分化过程获得了转化体。刘慧春(2012)利用红掌“阿拉巴马”的叶片为外植体，农杆菌介导，将绿色荧光蛋白基因gfp和脂肪酸去饱和酶基因fad3转化红掌，通过g418和卡那霉素筛选，获得了转基因红掌植株。对于鉴定佛焰苞颜色调控基因功能，采用上述转化方法，操作要求高、难度大、技术环节复杂、周期长，移栽成活后至开花，需要1～2年时间。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用红掌‘雪玉’进行花青素合成基因功能快速验证的方法。本专利技术以‘雪玉’未开放花序为材料，直接利用注射器将目的基因的菌液注入花梗，15-20d待佛焰苞完全展开后，即可观察表型变化。该方法直接注射，技术简单易掌握，不需要经过利用红掌叶片、茎段等外植体进行遗传转化中的侵染、共培养、筛选培养、增殖、生根、移栽等过程；该技术所需周期短，从注射结束到可以观察表型仅需15～20d；本专利技术工艺流程简单，效率高，可以快速进行基因的功能验证。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种利用红掌‘雪玉’进行花青素合成基因功能快速验证的方法，所述方法利用注射器将包含红掌anufgt1基因的农杆菌导入‘雪玉’尚未展开的幼嫩佛焰苞花梗，然后待佛焰苞展开后，及时进行表型观察；
4、所述导入方法具体为：在未展开佛焰苞下1～3cm的花梗位置，斜向下刺入2-3mm，轻轻且缓慢推注射器1～3μl，用凡士林涂抹针孔周围，同时拔出注射器；第二天在同一花梗上，第一次注射点向上0.4～0.6cm的位置注射第二次；第三天在同一花梗上，第二次注射点向上0.4～0.6cm的位置注射第三次。
5、优选的，所述方法具体包括以下步骤：
6、(1)选取具有尚未展开佛焰苞的‘雪玉’植株；
7、(2)收集含anufgt1基因表达载体的菌体，重悬至od600为0.8～1.0，然后用无菌胰岛素注射器吸取10～20μl菌液；
8、(3)在未展开佛焰苞下1～3cm的花梗位置，斜向下刺入2-3mm，轻轻且缓慢推注射器1～3μl，用凡士林涂抹针孔周围，同时拔出注射器；第二天在同一花梗上，第一次注射点向上0.4～0.6cm的位置注射第二次；第三天在同一花梗上，第二次注射点向上0.4～0.6cm的位置注射第三次；
9、(4)被注射后的红掌置于原来的温室中正常管理，注意防治昆虫；
10、(5)14～15d后，待被注射佛焰苞完全展开但尚未开花前，及时从基部剪取花序，立即插入清水中，带到实验室，利用体式显微镜进行观察与拍照记录。
11、优选的，所述步骤(1)中选取的‘雪玉’为花青素缺失的白色系品种(can20090270.0)，植株苗龄2～3年，室温栽培，正常开花，保存于国家热带作物中期库。
12、优选的，所述步骤(2)中anufgt1基因克隆使用的引物序列如seq id no.1～seqidno.4所示。
13、优选的，所述步骤(2)中表达载体构建使用的载体为pbi121，限制性内切酶为kpnⅰ和xbaⅰ，大肠杆菌菌株为dh5α，农杆菌菌株为eha105。
14、优选的，所述步骤(2)中的重悬采用4～6％蔗糖和0.01～0.03％silwet77转化液进行。
15、进一步优选的，所述重悬采用5％蔗糖和0.02％silwet77转化液进行。
16、优选的，所述步骤(3)的具体过程为：在未展开佛焰苞下2cm的花梗位置，斜向下刺入2-3mm，轻轻且缓慢推注射器2μl，用凡士林涂抹针孔周围，同时拔出注射器；第二天在同一花梗上，第一次注射点向上0.5cm的位置注射第二次；第三天在同一花梗上，第二次注射点向上0.5cm的位置注射第三次。
17、与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：
18、本专利技术工艺流程简单，效率高，以未‘雪玉’未开放花序为材料，直接利用注射器将目的基因的菌液注入花梗，15～20d后，待佛焰苞完全展开后，即可观察表型变化。该方法直接注射，技术简单易掌握，不需要经过利用红掌叶片、茎段等外植体进行遗传转化中的侵染、共培养、筛选培养、增殖、生根、移栽等过程；该技术所需周期短，从注射结束到可以观察表型仅需15～20d，可以快速进行基因的功能验证。
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1.一种利用红掌‘雪玉’进行花青素合成基因功能快速验证的方法，其特征在于，所述方法利用注射器将包含红掌AnUFGT1基因的农杆菌导入‘雪玉’尚未展开的幼嫩佛焰苞花梗，然后待佛焰苞展开后，及时进行表型观察；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中选取的‘雪玉’为花青素缺失的白色系品种(CAN20090270.0)，植株苗龄2～3年，室温栽培，正常开花，保存于国家热带作物中期库。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中AnUFGT1基因克隆使用的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中表达载体构建使用的载体为PBI121，限制性内切酶为KpnⅠ和XbaⅠ，大肠杆菌菌株为DH5α，农杆菌菌株为EHA105。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的重悬采用4～6％蔗糖和0.01～0.03％Silwet77转化液进行。<...
【技术特征摘要】
1.一种利用红掌‘雪玉’进行花青素合成基因功能快速验证的方法，其特征在于，所述方法利用注射器将包含红掌anufgt1基因的农杆菌导入‘雪玉’尚未展开的幼嫩佛焰苞花梗，然后待佛焰苞展开后，及时进行表型观察；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中选取的‘雪玉’为花青素缺失的白色系品种(can20090270.0)，植株苗龄2～3年，室温栽培，正常开花，保存于国家热带作物中期库。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中anufgt1基因克隆使用的引物序列如seq id no.1～seq id no.4所示。
...【专利技术属性】
技术研发人员：李志英，荆永琳，徐立，唐翠，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：
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