【技术实现步骤摘要】
本申请涉及细胞生物技术的，更具体地说，涉及一种血小板裂解液及其制备方法和应用。
技术介绍
1、血小板中存在各种蛋白(纤维蛋白等)和生长因子(包括转化生长因子-β(tgf-β)、胰岛素样生长因子-1(igf-1)、血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、血小板源性生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)等多种生长因子)。血小板裂解液是富血小板血浆(platelet-rich plasma，prp)的衍生物，是将浓缩血小板进一步裂解，释放其细胞因子和生长因子混合物制成的细胞培养液，不仅除去了残余细胞结构，降低了免疫原性，而且保留了细胞生长和增殖需要的各种生长因子和生物活性蛋白。通过释放人血小板裂解液中的各种因子和生物蛋白的方法制备的血小板裂解液已被确定为一种合适的替代胎牛血清作为培养基补充，使人细胞在无动物血清条件下高效繁殖。
2、脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)通常是指来源于发育早期胚胎层的具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，并能在特定条件下分化为软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。在成体干细胞中，间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中，特别是骨髓、脂肪组织、脐血，甚至外周血也发现有间充质干细胞。由于间充质干细胞具有强大的增殖能力、较强的多向分化潜能以及其低免疫原性和免疫调节功能，称为组织工程的理想种子细胞，因而在细胞替代治疗和组织工程方面显示出巨大价值而备受关注。
3、目前，根据已上市的间充质干细胞培养基来看，主要可以分为以下几种，
4、相关技术中公开了血小板裂解液的制备方法。例如：一种血小板裂解液及其制备方法，该血小板裂解液的制备方法包括如下步骤：制备所需浓度血小板的富血小板血浆；将富血小板血浆置于-20℃冰箱冰冻保存24h，取出置于37℃水浴箱中解冻5min；重复以上冻融过程；将最后一次解冻的富血小板血浆离心，取上清液，即为血小板裂解液。再如：一种内皮细胞培养液的制备方法，该内皮细胞培养液包括血小板裂解液，该血小板裂解液的制备方法包括以下步骤：采人血小板置入离心瓶中离心处理；去上清，加入生理盐水洗血小板，离心后用生理盐水重悬；置于-20℃冰箱中，冷冻过夜，然后置于室温下直至完全融化；重复三次以上冻融过程，即得血小板裂解液。
5、然而，上述血小板裂解液的制备方法中，血小板裂解液在冻存和复苏后会出现大量的纤维蛋白，会影响细胞培养的效果。
技术实现思路
1、本申请提供一种血小板裂解液及其制备方法和应用。
2、本申请的制备方法能够明显提高血小板裂解液中细胞因子的含量，并且能够提高人脐带间充质干细胞从脐带组织中爬出的产率，培养期间减少或无纤维蛋白的释出，避免了其它杂质的出现，具有成分明确，批次稳定，微生物污染低等优点。
3、本申请提供一种充分裂解浓缩血小板的制备方法，从而制备高效的血小板裂解液，只需要基础培养基(dmem-f12)+百分比的血小板裂解液，就能提高刺激脐带中的间充质干细胞从脐带爬出的数量。
4、本申请提供的制备方法能够明显提高血小板的裂解比例，所获取的浓缩血小板裂解液与基础培养基充分混匀配制后，与市场上商业培养基(同样含血小板裂解液)对比，其刺激效果更为明显。
5、第一方面，本申请提供一种血小板裂解液的制备方法，采用如下的技术方案：
6、一种血小板裂解液的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
7、(1)将抗凝全血离心，收集富含血小板的血浆混合物；
8、(2)将所述富含血小板的血浆混合物离心，收集血浆上清加热灭活并离心，获得灭活后的血浆；
9、(3)收集步骤(2)离心获得的血小板颗粒沉淀，清洗并用所述灭活后的血浆重悬，制备浓缩血小板颗粒悬液；
10、(4)将所述浓缩血小板颗粒悬液超声处理，离心并收集富含浓缩血小板的裂解液；
11、(5)向所述富含浓缩血小板的裂解液中加入葡萄糖酸钙，加热至形成凝块，机械挤压拧干凝块并将拧出的液体离心收集上清液；
12、(6)将所述上清液过滤除菌，即得所述血小板裂解液。
13、在一个具体的实施方式中，抗凝全血可以是通过将多份来源不同的健康人的抗凝全血按照血型比例混匀获得。
14、在一个具体的实施方式中，抗凝全血包括以下重量份血型的抗凝全血：o型血3-6份；ab型1-3份。
15、在一个具体的实施方式中，步骤(1)中所述离心的转速为1500-5000rpm，所述离心的时间为10-30min。
16、在一个具体的实施方式中，所述富含血小板的血浆混合物可以是通过将多组富含血小板的血浆混合物混合获得。
17、在一个具体的实施方式中，可以将多组血浆上清收集并加热灭活。
18、在一个具体的实施方式中，多组血浆上清的数量为2-6组。
19、在一个具体的实施方式中，所述加热灭活的方式为水浴锅加热。
20、在一个具体的实施方式中，灭活后的血浆存储的条件为冰箱存储。
21、在一个具体的实施方式中，灭活后的血浆存储的条件为-20℃冰箱存储。
22、在一个具体的实施方式中，步骤(2)中加热灭活前所述离心的转速为1000-2000rpm，所述离心的时间为10-30min。
23、在一个具体的实施方式中，所述加热灭活的温度为30-60℃，所述加热灭活的时间为20-50min。
24、在一个具体的实施方式中，步骤(2)中加热灭活后所述离心的转速为1000-2000rpm，所述离心的时间为10-30min。
25、在一个具体的实施方式中，步骤(3)中所述血小板颗粒沉淀为2-5组血小板颗粒沉淀的集合。
26、在一个具体的实施方式中，步骤(3)中所述血小板颗粒沉淀为5组血小板颗粒沉淀的集合。
27、在一个具体的实施方式中，步骤(3)中所用的所述灭活后的血浆为8-16ml。
28、在一个具体的实施方式中，步骤(4)中所述浓缩血小板颗粒悬液中血小板数量至少达到(1-3)×1011颗/l。
29、在一个具体的实施方式中，步骤(4)中所述超声处理的时间为20-50min，所述超声处理的功率为10-30kh。
30、在一个具体的实施方式中，步骤(4)中所述离心的转速为1000-2000rpm，所述离心的时间为10-30min。
31、在一个具体的实施方式中，步骤(5)中所述葡萄糖酸钙为葡萄糖酸钙溶液。
32、在一个具体的实本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种血小板裂解液的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗凝全血包括以下重量份血型的抗凝全血：O型血3-6份；AB型1-3份。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述离心的转速为1500-5000rpm，所述离心的时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下a-c中的任意一项：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下d-f中的任意一项：
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述超声处理的时间为20-50min，所述超声处理的功率为10-30kh。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下g-i中的任意一项：
8.利用权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的血小板裂解液。
9.一种权利要求8所述的血小板裂解液在原代人间充质干细胞培养中的应用。
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...【技术特征摘要】
1.一种血小板裂解液的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗凝全血包括以下重量份血型的抗凝全血：o型血3-6份；ab型1-3份。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述离心的转速为1500-5000rpm，所述离心的时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下a-c中的任意一项：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下d-f中的任意一项：
【专利技术属性】
技术研发人员：谢委翰，李静仪，黄彬彬，
申请(专利权)人：中科睿极海宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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