【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种病毒样颗粒及其构建方法和应用。
技术介绍
1、基因治疗药物需通过血管内皮屏障、细胞外基质、靶向组织细胞膜，最终达到靶点。其中，核酸、抗体等大分子药物相较于小分子进入靶向目标更具备难度，为此科学家开发了各种递送体系帮助这类药物更好的达到靶点位置。
2、目前，常见的mrna递送系统包括病毒系统和非病毒系统。
3、病毒系统主要包括腺病毒载体(adv)及腺相关病毒载体(aav)和慢病毒(lv)载体等。其中，腺病毒载体(adv)是应用最广泛的病毒载体，但其具有高免疫原性，易引起机体免疫反应。腺相关病毒载体(aav)装载量较小。慢病毒(lv)载体存在插入突变风险，易发生脱靶效应，因此在临床上的使用受到了限制。
4、非病毒递送系统主要包括聚合物材料、多肽、脂质体纳米粒子(lnps)等。其中，聚合物材料类一般毒性较强，在体内不易降解，目前大都处于临床前研究阶段。多肽类递送载体主要集中在细胞穿膜肽，但该技术尚未成熟，且无靶向选择性。以脂质体(lnps)为载体制备的mrna制剂会在肝脏及脾脏聚集，难以靶向其他部位，且易发生渗漏。
5、病毒样颗粒(vlp，virus-like particle)是一类能够自组装的，具有病毒外部特征但不包含病毒遗传物质，不具备感染能力的纳米颗粒。vlp可以通过多种表达系统获得，如哺乳细胞、植物、昆虫和细菌表达系统。vlp具有良好的生物兼容性、生物降解性和靶向递送安全性高，内部容量大，易获得，使用方便等特点。
6、vlp可
7、新型冠状病毒(sars-cov-2)病毒粒子直径约100nm，具有4种结构蛋白，包括刺突(s)蛋白、膜(m)蛋白、包膜(e)蛋白和核衣壳(n)蛋白。刺突蛋白在(sars-cov-2中为1273aa)前体可被切割成2个糖基化的亚基s1和s2，s1与宿主受体ace2结合，而s2介导病毒和宿主膜融合，s蛋白易引起机体强烈的免疫反应。核衣壳蛋白(sars-cov-2中约为419aa)与病毒基因组rna结合并形成螺旋核糖核衣壳，参与基因组保护、病毒rna复制、病毒体组装和免疫逃避。膜蛋白(在sars-cov-2中约为222aa)是病毒体中最丰富的结构成分，序列非常保守。膜蛋白通过将其他结构蛋白征召到“er-高尔基体中间区(ergic)”来介导病毒颗粒的组装和出芽。它与核衣壳蛋白相互作用，将rna包装到病毒体中。包膜蛋白(在sars-cov-2中约为75aa)参与病毒装配、出芽和发病机理。包膜蛋白可形成同质五聚体离子通道的病毒孔蛋白，也与m，n，3a和7a相互作用。现有研究表明，冠状病毒形成vlp时需要m、e、s和n中的两种或多种结构蛋白，由m、e、s和n蛋白组成的新冠病毒样颗粒目前常用作mrna疫苗载体。
8、冠状病毒含有较大的rna基因组(26～32kb)，可以克服其他载体装载mrna等核酸类药物长度较短的缺点。新冠病毒样颗粒的最简单结构可由m、e和n中的两种或三种结构蛋白形成，其中大量的研究报道m和e蛋白是形成新冠病毒样颗粒的必要结构蛋白。对于sars-cov-2的vlp装载核酸药物能否在临床开展应用的难点问题是如何移除其膜外的抗原表位，降低免疫原性。因此，在只含有m和e或者m、e、n的sars-cov-2的vlp自组装过程中，将m的大部分跨膜结构及膜外有免疫原性的结构截短是解决该问题的主要思路。为此，本专利技术专利首次设计并验证了截短的m蛋白可以形成sars-cov-2的vlp，并且可以用于mrna等的药物递送。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中mrna递送体系中病毒递送体系存在装载量较小，具有免疫原性，易引发机体免疫反应等问题，提供一种病毒样颗粒及其构建方法和应用。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、一种病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由新型冠状病毒的膜蛋白、包膜蛋白(e)和核衣壳蛋白(n)三种蛋白组成或所述膜蛋白和包膜蛋白(e)两种蛋白组成。
4、新型冠状病毒的膜蛋白、包膜蛋白(e)和核衣壳蛋白(n)通过转染可以合成病毒样颗粒(vlp)，其中仅靠膜蛋白、包膜蛋白(e)两种蛋白也可合成体积更小的病毒样颗粒(vlp)。
5、其中seq id no:1的序列为：
6、
7、其中seq id no:2的序列为：
8、
9、
10、其中seq id no:3的序列为：
11、
12、其中seq id no:4的序列为：
13、
14、优选的，所述膜蛋白为完整的膜蛋白(m)或截短的膜蛋白(mt)。
15、完整的膜蛋白(m)包括n端的膜外区和三个跨膜区以及c端的膜内区，其中n端的膜外区具有免疫原性，在膜外易被抗体识别，从而被抗体清除。截短的膜蛋白(mt)截去了n端膜外区和两个跨膜区，解决了合成的vlp被抗体识别从而被清除的问题。
16、优选的，所述截短的膜蛋白(mt)的质粒构建方法包括以下步骤：
17、t1、将现有的pcdna 3.4-m质粒用kod酶，进行pcr扩增；
18、t2、将pcr产物进行酶切，用1％琼脂糖，120v恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的ep管中用于胶回收纯化；
19、t3、将连接产物与感受态细胞一同转化，培养扩增转化后的细胞，涂布培养，筛选质粒单菌落，得到截短的膜蛋白(mt)的质粒。
20、用kod酶对现有的pcdna 3.4-m质粒进行切割，然后通过pcr对切割后的片段进行扩增，收集dna片段，并转化到感受态细胞内培养，筛选纯化后，得到含有截短的膜蛋白(mt)质粒的细胞。
21、优选的，制备所述病毒样颗粒时需要的质粒比例为完整的膜蛋白(m)基因的质粒：包膜蛋白(e)基因的质粒：核衣壳蛋白(n)基因的质粒＝4：0.2-4：0.2-4，截短的膜蛋白(mt)基因的质粒：包膜蛋白(e)基因的质粒：核衣壳蛋白(n)基因的质粒＝4：0.2-4：0.2-4，完整的膜蛋白(m)基因的质粒：包膜蛋白(e)基因的质粒＝4：0.2-4，截短的膜蛋白(mt)基因的质粒：包膜蛋白(e)基因的质粒＝4：0.2-4中的一种或多种。
22、通过新型冠状病毒的上述质粒组合，均可以合成病毒样颗粒(vlp)。
23、一种病毒样颗粒的构建方法，包括如下步骤：
24、s1、选本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由新型冠状病毒的膜蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白三种蛋白组成或所述膜蛋白、包膜蛋白两种蛋白组成，所述包膜蛋白的序列为SEQ ID No：1，所述核衣壳蛋白的序列为SEQ ID No：2。
2.根据权利要求1所述的一种病毒样颗粒，其特征在于，所述膜蛋白为完整的膜蛋白或截短的膜蛋白，所述完整的膜蛋白序列为SEQ ID No：3，所述截短的膜蛋白的序列为SEQ IDNo：4。
3.根据权利要求2所述的一种病毒样颗粒，其特征在于，所述截短的膜蛋白的质粒构建方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种病毒样颗粒，其特征在于，制备所述病毒样颗粒时需要的质粒比例为完整的膜蛋白基因的质粒：包膜蛋白基因的质粒：核衣壳蛋白基因的质粒=4：0.2-4：0.2-4，截短的膜蛋白基因的质粒：包膜蛋白基因的质粒：核衣壳蛋白基因的质粒=4：0.2-4：0.2-4，完整的膜蛋白基因的质粒：包膜蛋白基因的质粒=4：0.2-4，截短的膜蛋白基因的质粒：包膜蛋白基因的质粒=4：0.2-4中的一种或多种。
5.根据权利要求1-
6.根据权利要求5所述的一种病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，所述目的基因为能够形成mRNA的真核生物DNA，优选的，所述目的基因包括pcDNA3.1-mCherry、pEGFP-BBC3和pEGFP-C1中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的一种病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中哺乳动物细胞为HEK-293t细胞、A549细胞和PC9细胞中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的一种病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，转染过程可以实现目的基因在哺乳动物细胞中的正常表达。
9.根据权利要求5所述的一种病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，所述步骤S6中，检测方法为：动态光散射分析、蛋白免疫印迹检测和负染电镜观察中的一种或多种。
10.根据权利要求1-9所述的任意一种病毒样颗粒的应用，其特征在于，所述病毒样颗粒可用作核酸类药物的递送工具。
...【技术特征摘要】
1.一种病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由新型冠状病毒的膜蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白三种蛋白组成或所述膜蛋白、包膜蛋白两种蛋白组成，所述包膜蛋白的序列为seq id no：1，所述核衣壳蛋白的序列为seq id no：2。
2.根据权利要求1所述的一种病毒样颗粒，其特征在于，所述膜蛋白为完整的膜蛋白或截短的膜蛋白，所述完整的膜蛋白序列为seq id no：3，所述截短的膜蛋白的序列为seq idno：4。
3.根据权利要求2所述的一种病毒样颗粒，其特征在于，所述截短的膜蛋白的质粒构建方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种病毒样颗粒，其特征在于，制备所述病毒样颗粒时需要的质粒比例为完整的膜蛋白基因的质粒：包膜蛋白基因的质粒：核衣壳蛋白基因的质粒=4：0.2-4：0.2-4，截短的膜蛋白基因的质粒：包膜蛋白基因的质粒：核衣壳蛋白基因的质粒=4：0.2-4：0.2-4，完整的膜蛋白基因的质粒：包膜蛋白基因的质粒=4：0.2-4，截短的膜蛋白基因的质粒：包膜蛋白基因的质粒=4：0.2-4中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘义，陈香俊，张正，胡楠，胡丛武，余婷婷，
申请(专利权)人：四川轻化工大学，
类型：发明
国别省市：
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