一种靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒及其制备方法和应用，属于药物制剂技术领域，涉及一种可吸入给药的、多肽修饰的靶向气道上皮细胞的脂质纳米粒制备方法及其在治疗肺部相关疾病中的应用。本发明专利技术所述的靶向气道上皮细胞是由靶向上皮细胞的ICAM‑1受体的多肽实现的，该多肽包括段靶向ICAM‑1的肽链和一段桥连肽连组成。含有该靶向多肽的脂质纳米粒具有比普通脂质纳米粒更强的上皮细胞转染效率，肺部吸入给药后可以将更多的siRNA药物精准递送至气道上皮细胞，大幅提高对哮喘等肺部相关疾病的治疗效果，在肺部疾病治疗方面具有广阔的应用前景。
1、小干扰rna(sirna)作为一种核酸药物，在识别和沉默靶基因表达方面具有高特异性和有效性，使其在肺部疾病如肺癌、肺囊性纤维化、慢性阻塞性肺病、急性肺损伤及哮喘疾病的治疗方面具有广泛的应用前景。脂质纳米(lnps)是目前最先进的sirna药物递送系统之一，通过注射给药lnps可将sirna靶向递送至肝脏，实现了sirna用于肝脏相关疾病的治疗。然而，对于肝脏以外的器官，如何将sirna高效递送至靶器官和靶细胞是制约sirna药物开发的瓶颈，是现有技术无法解决的问题。
2、相对于注射给药途径，肺部吸入给药是提高sirna在肺部组织浓度、达到较高的基因沉默水平的重要策略之一。气道上皮细胞是先天免疫和炎症反应重要组成部分，参与多种肺部疾病如哮喘、慢性阻塞性肺病以及肺囊性纤维化的发生发展过程，是肺部吸入给药的一个重要靶细胞。配体修饰是核酸药物靶向递送的有效策略。通过配体修饰，可提高靶细胞的特异性转染，减少由非靶细胞的非选择性摄取而导致的副作用。细胞间粘附分子1(icam-1，又称为cd54)，是表达于气道上皮细胞顶侧的受体，该受体在多种疾病的病理状态下表达水平增高。针对该受体蛋白设计sirna靶向递送的载体系统，有望实现经肺部吸入给药后sirna在气道上皮细胞的高选择性转染，用于治疗气道上皮细胞相关的肺部疾病。
>1、本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可靶向气道上皮细胞icam-1受体的多肽。多肽经脂质修饰，形成靶向多肽-胆固醇共轭物后，与可解离脂质、胆固醇及辅助脂质共同自组装成纳米粒，靶向多肽主要富集在纳米粒表面。纳米粒表面的靶向多肽使纳米粒通过icam-1受体介导的内吞作用被气道上皮细胞选择性摄取，实现逃逸溶酶体，将sirna释放到胞质中发挥基因沉默效果。通过下调关键致病基因的表达，干预疾病进程，治愈肺部相关疾病。2、一种靶向气道上皮细胞的载小干扰rna脂质纳米粒，由可解离脂质、辅助脂质、胆固醇及靶向多肽-胆固醇共轭物组成，其中，可解离脂质通过静电作用与sirna相结合。
3、所述的脂质纳米粒中可解离脂质、辅助脂质、胆固醇及靶向多肽-胆固醇共轭物的摩尔比为(25～50):(25～40):(20～40):(0.5～12)，优选摩尔比为(30～45):(30～40):(25～35):(0.5～8)。
4、所述的脂质纳米粒靶向的气道上皮细胞的受体为细胞间粘附分子1(简称icam-1又称cd54)。
5、所述的可解离脂质为氨基脂质二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(dlin-mc3-dma，简称mc3)，所述的可解离脂质中可质子化的氨基和sirna的磷酸基团的比(氮磷比)为(4:1)～(30:1)，优选(10:1)～(20:1)。
6、所述的辅助脂质为二油酰基卵磷脂(dopc)、二棕榈酸磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)中的任意一种。
7、所述的靶向多肽-胆固醇共轭物是通过(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)将胆固醇琥珀酸单酯(chems)中的羧基活化，通过酰胺键和靶向多肽链接制备得到。
8、其中，所述的靶向多肽由靶向icam-1的多肽链x和一段桥连肽链y两部分组成，其中x的氨基酸序列为csersmnfc、cyglphkfc及clphksmpc中的任意一种，桥连序列为含有天冬酰胺(n)和/或甘氨酸(g)的3～10个氨基酸序列。
9、所述的胆固醇琥珀酸单酯还可以为β-谷甾醇琥珀酸单酯、麦角甾醇琥珀酸单酯、菜籽甾醇琥珀酸单酯、豆甾烷醇琥珀酸单酯中的任一种。
10、所述的edc、nhs与胆固醇琥珀酸单酯的摩尔比例为(1～2):(1～2):1，优选为(1.1～1.5):(1.1～1.5):1。
11、所述的靶向多肽与胆固醇琥珀酸单酯的摩尔比例为(1.1～1.5):1，优选为1.2:1。
12、本专利技术的另一个目的是提供所述靶向气道上皮细胞的载sirna脂质纳米粒的制备方法。具体通过以下步骤实现：
13、将靶向多肽-胆固醇共轭物、可解离脂质mc3、辅助脂质和胆固醇溶于无水乙醇中制备得到脂质乙醇溶液。将sirna按一定的氮磷比(可解离脂质中的可质子化的氨基数目与sirna磷酸基团数目的比)溶于等体积的ph 4.0的柠檬酸缓冲液中，在剧烈搅拌的状态下将含sirna的水相加入上述脂质的乙醇溶液中，搅拌均匀后立即加入ph4.0的缓冲液进一步稀释。稀释后的纳米粒中加入ph 7.4的pbs缓冲液，超滤，制得靶向气道上皮细胞的载sirna脂质纳米粒。
14、所述的脂质纳米粒中可解离脂质、辅助脂质、胆固醇及靶向多肽-胆固醇共轭物的摩尔比为(25～50):(25～40):(20～40):(0.5～12)，优选摩尔比为(30～45):(30～40):(25～35):(0.5～8)。
15、所述的脂质乙醇溶液的浓度为5mm～10mm，优选的为5mm。
16、所述的氮磷比为(4:1)～(30:1)，优选的氮磷比为(10:1)～(20:1)。
17、本专利技术的第三个目的是提供所述靶向气道上皮细胞的载sirna脂质纳米粒在表达icam-1的细胞中的转染及肺部疾病治疗药物中的应用。该靶向多肽具有较强的icam-1受体的靶向性，连有该靶向多肽的脂质纳米粒递送载体可以将更多的sirna精准递送气道上皮细胞，提高基因沉默效果。在肺部疾病如哮喘、慢性阻塞性肺病及肺囊性纤维化中的气道上皮细胞会发生多个基因靶点的表达上调，因此针对的气道上皮细胞的sirna靶向递送载体具有广阔的应用前景。
18、本专利技术的有益效果：
19、本专利技术以脂质、靶向多肽作为载体材料，通过处方筛选等，制备出可经肺部吸入的靶向气道上皮细胞的递送载体，实现sirna在气道上皮细胞的选择性转染。sirna药物通过调控基因表达在延缓哮喘、慢性阻塞性肺疾病的发展进程、防止疾病加重以及开发个体化药物方面有着巨大前景，为呼吸系统疾病的控制和治疗提供新的思路和策略。
20、本专利技术中的脂质纳米粒的制备易于实现工业化生产，并且可以安全有效地实现核酸药物通过肺部吸入应用于哮喘等呼吸道疾病的治疗，其特异性和选择性强的优势可以很好地解决目前核酸药物作用广泛而引发的不良反应，可为后期肺部吸入的核酸类药物的应用奠定坚实基础和提供科学理论依据。
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【技术保护点】
1.一种靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒，其特征在于，由可解离脂质、辅助脂质、胆固醇及靶向多肽-胆固醇共轭物组成，其中，可解离脂质通过静电作用与siRNA相结合；
2.根据权利要求1所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒，其特征在于，所述的脂质纳米粒中可解离脂质、辅助脂质、胆固醇及靶向多肽-胆固醇共轭物的摩尔比为(25～50):(25～40):(20～40):(0.5～12)。
3.根据权利要求1所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒，其特征在于，所述的靶向多肽由靶向ICAM-1的多肽链X和一段桥连肽链Y两部分组成，其中X的氨基酸序列为CSERSMNFC、CYGLPHKFC及CLPHKSMPC中的任意一种，桥连序列为含有天冬酰胺(N)和/或甘氨酸(G)的3～10个氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒，其特征在于，所述的胆固醇琥珀酸单酯还可以为β-谷甾醇琥珀酸单酯、麦角甾醇琥珀酸单酯、菜籽甾醇琥珀酸单酯、豆甾烷醇琥珀酸单酯中的任一种。
5.根据权利要求1所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒，其特征在于，所述的EDC、NHS与胆固醇琥珀酸单酯的摩尔比例为(1～2):(1～2):1，所述的靶向多肽与胆固醇琥珀酸单酯的摩尔比例为(1.1～1.5):1。
6.一种权利要求1-5任一项所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
7.根据权利要求6所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的脂质纳米粒中可解离脂质、辅助脂质、胆固醇及靶向多肽-胆固醇共轭物的摩尔比为(25～50):(25～40):(20～40):(0.5～12)。
8.根据权利要求6所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的脂质乙醇溶液的浓度为5mM～10mM，所述的氮磷比是指可解离脂质中的可质子化的氨基数目与siRNA磷酸基团数目的比，为(4:1)～(30:1)。
9.权利要求1-5任一项所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰RNA脂质纳米粒在表达ICAM-1的细胞中的转染及肺部疾病治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肺部疾病为哮喘、慢性阻塞性肺病或肺囊性纤维化。
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【技术特征摘要】
1.一种靶向气道上皮细胞的载小干扰rna脂质纳米粒，其特征在于，由可解离脂质、辅助脂质、胆固醇及靶向多肽-胆固醇共轭物组成，其中，可解离脂质通过静电作用与sirna相结合；
2.根据权利要求1所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰rna脂质纳米粒，其特征在于，所述的脂质纳米粒中可解离脂质、辅助脂质、胆固醇及靶向多肽-胆固醇共轭物的摩尔比为(25～50):(25～40):(20～40):(0.5～12)。
3.根据权利要求1所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰rna脂质纳米粒，其特征在于，所述的靶向多肽由靶向icam-1的多肽链x和一段桥连肽链y两部分组成，其中x的氨基酸序列为csersmnfc、cyglphkfc及clphksmpc中的任意一种，桥连序列为含有天冬酰胺(n)和/或甘氨酸(g)的3～10个氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰rna脂质纳米粒，其特征在于，所述的胆固醇琥珀酸单酯还可以为β-谷甾醇琥珀酸单酯、麦角甾醇琥珀酸单酯、菜籽甾醇琥珀酸单酯、豆甾烷醇琥珀酸单酯中的任一种。
5.根据权利要求1所述的靶向气道上皮细胞的载小干扰rna脂质纳米粒，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨明世，张梦君，寸冬梅，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：
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