本发明专利技术提供了一株黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．ＺＤ００１）及其在微生物发酵制备结冷胶中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，４３００７２，保藏日期：２００９年０９月１０日，保藏编号：ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ ２０９１９８。本发明专利技术的有益效果主要体现在：该菌株发酵液不含黄色素而呈乳白色，只需用少量的乙醇或异丙醇沉淀多糖，即可得到无色优质的结冷胶，可使结冷胶生产简化后续提纯脱色工艺，提高得率，降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一抹黄色素生成缺陷但能生产正常品质结冷胶的鞘脂单胞菌菌株ZD001 (Sp/z/gomoay取ZD001 )及其在孩t生物发酵制备结冷 胶中的应用。 '(二)
技术介绍
结冷胶 (Gellan Gum)是少动鞘月旨单胞菌 (559/2/gowM p薦c/w6/fo')经好氧发酵产生的微生物胞外多糖，由美S Kelco公司于 1978年开发成功。它是继黄原胶之后又一种无毒、安全、理化性质优良 的微生物胞外多糖。日本早在1988年就准许在食品中使用，美国于1992 年获FDA批准而用于食品，我国于1996年批准其作为食品增稠剂、稳 定剂使用，另有十多个国家也已批准用作食品添加剂。近年来，结冷胶以 其独特的优良特性，被作为新型乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶 剂、缓释剂、成膜材料等日益广泛地应用于食品、医药、化工等工业领域， 应用前景广阔。结冷胶是由(3-1,3-D-葡萄糖，(3-1,4-D-葡萄糖醛酸和a-1,4-L-鼠李糖按 摩尔比2 : 1 : l组成，其以(3-l,3画D-葡萄糖、卩-l,4-D画葡萄糖搭酸、卩隱1,3-D-葡萄糖、a-l,4-L-鼠李糖的连接顺序构成四糖单元。在四糖单元聚合形成 的糖长链骨架上连有酰基，分子量一般为5x105-lxl()S道尔顿左右。结冷 胶主要以两种形式存在，即未经脱酰基的高酰基结冷胶(也称天然结冷胶) 和经物理化学方法人工脱酰基的低酰基结冷胶。高酰基天然结冷胶中有两 种酰基，即乙酰基和甘油酰基，通常乙酰基连接在第一个葡萄糖残基的5C6位上，而甘油酰基连接在同一个葡萄糖残基的C2位上， 一般每个四糖 单元中平均含有l个甘油酰基，0.5个乙酰基。低酰基结冷胶则是由高酰基 结冷胶通过脱酰基处理后而基本上不含酰基的产物，因此，结冷胶分子因 是否脱酰基和脱酰基程度不同，分子量差异较大，目前在食品工业上应用 较多的是分子量相对较低的低酰基结冷胶。当前生产所用的结冷胶产生菌少动鞘脂单胞菌在发酵过程中同时会 产生代谢副产物黄色素(主要是类胡萝卜色素)，这不仅与结冷胶竟争碳 源，还使发酵液变黄。在结冷胶制备过程中，尤其是在高酰基结冷胶的制 备过程中，为了去除胶体中的黄色素，增加了结冷月交4是取脱色中乙醇或异 丙醇的用量( 一般用3倍发酵液体积的'乙醇或异丙醇)与操作时间，使提 取纯化的效率降低、成本提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一抹黄色素生成缺陷但能生产正常品质结冷胶的鞘脂单胞菌菌抹ZDOOl (5^/7/gowos w. ZD001 )。该ZD001菌抹已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址中国武汉武汉大学，邮政编码430072;保藏日期2009年9月10日；寸呆藏编号CCTCCNo:M209198。故该菌抹以下称ZD001 ( CCTCC NO: M 209198 )菌抹。 本专利技术采用的技术方案ZD001. ( CCTCC NO:M 209198 )菌林是本申请专利技术.人分离选育所得。 对其16S rDNA进行测序与分子比对，其与少动鞘脂单胞菌 (S卢g簡o廳拜'm。M/s ) 16S rDNA核苷酸序歹'J同源性为99%以上， 认定ZD001 (CCTCCNO: M209198)菌抹为已见报道的结冷胶产生菌少 动鞘脂单胞菌的同种变异抹。6所述ZD001 (CCTCC NO: M 209198)菌株的16S rDNA序列如下:AGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT。所述ZD001 (CCTCCNO:M 209198)菌抹特征如下为革兰氏阴性杆菌;无芽孢;直杆状；在营养琼脂平板上菌落呈乳白色；氧化酶试验阳性；接触酶试验阳性；专性需氧；分解葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖；淀粉水解试-验阳性；不能液化明胶；43不生长；菌体大小为1.5 5.(Vmx0.8-1.0^im;不产黄色素。本专利技术还涉及所述的ZD0Q1 (CCTCC NO: M 209198 )菌4朱在微生物发酵制备结冷胶中的应用。具体的，所述应用为将所述ZDOOl (CCTCC NO:M 209198 )菌抹按常规方法经活化、种子培养后，接种至常规适用于鞘脂单胞菌的发酵培养基，28 32°C、 pH6.8~7.2摇床培养32~60h,获得含有高酰基结冷胶的发酵液。该发酵液可直接分离纯化得到高酰基结冷胶，也可进行脱酰基处理制取低酰基结冷胶。制备产物为高酰基结冷胶时，方法如下将所述含有高酰基结冷胶的发酵液调pH值为5.0 6.0，升温至50。C 70。C(优选60°C )保温30min 2h(优选lh)后，降温至4(TC 5(TC,调pH为7.0,加入溶菌酶和石咸性蛋白酶保温lh 3h (优选2h)去除蛋白质；去除蛋白质后的发酵液加入絮凝剂溶液进行絮凝沉淀(絮凝剂溶液加入量约为去除蛋白质后发酵液体积的5%),再经分离(加入体积为发酵液体积30%左右的体积浓度卯°/0以上的异丙醇或乙醇，说选95%异丙醇，搅拌，板框压滤)、干燥(90。C)，制得所述高酰基结冷胶，所述絮凝剂(浓度通常为20%, w/v)为下列之一或其中两种以上的混合CaCl2、 MgCl2、 NaCl、 KC1。制备产物为低酰基结冷胶时，方法如下往所述含有高酰基结冷胶的发酵液中加入碱金属或碱土金属氯化物溶液(浓度通常为20%， w/v)，调pH为11.0，固液分离(板框固液分离)得到纤维料1,将纤维料1与水按1: 4~6体积比混合，调pH2.5~4.0 (优选pH3.0 ),洗涤15min lh (优选30min),压滤得到纤维料2，将纤维料2与水按1: 9 12体积比混合均匀，升温至80。C 卯。C(优选83。C 87。C ),加入碱性试剂调pH为9.5 10.5(优选pH9.8 10.2 )反应8min 15min (优选10min 12min )，反应结束后调反应液pH为中性，加入助滤剂(添加量为1 3%, w/v,.优选2%),过滤，取滤液加入絮凝剂(优选10%质量浓度，添加体积为滤液体积的5%)进行絮凝沉淀，再经分离、干燥，制得所述低酰基结冷胶；所迷碱金属或碱土金属氯化物为下列之一或其中两种以上的混合CaCl2、MgCl2、NaCl、KC1 (优选CaCl2)，所述碱性试剂为下列之一或其中两种以上的混合NaOH、 KOH、 Na3P04,所述助滤剂为硅藻土、珍珠岩或其混合物，所述絮凝剂为下列之一或其中两种以上的混合CaCl2、 MgC、 NaCl、 KC1(优选KC1)。本专利技术的有益效果主要体现在:提供了 一抹黄色素生成缺陷的鞘脂单胞菌ZDOOl (CCTCCNO:M 209198)菌林，其发酵液不含黄色素而呈乳白色，提取时可减少乙醇或异丙醇用量，简化工序，提高得率，降低成本，利于工业化生产获得优质的结冷胶。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此实施例1: ZD001 (CCTCC NO: M 209198)菌林的分离及鉴定1、无菌采集土壤样品，稀释涂布于YM琼脂培养基平板上；92、 该平板置于30。C培养5天；3、 挑取不同形态的细菌菌落，于相同培养基平板分别划线纯化分离，置于30。C培养5天。YM琼脂培养基终浓度组成为0.30%酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＺＤ００１，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，４３００７２，保藏日期：２００９年０９月１０日，保藏编号：ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ ２０９１９８。
【技术特征摘要】
1.一株黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌(Sphingomonas sp.)ZD001，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2009年09月10日，保藏编号CCTCC NoM 209198。2. 如权利要求1所述的鞘脂单胞菌，其特征在于所述鞘脂单胞菌的16S rDNA序列'如下GGGAACCTGCGGCTGGATC ACCTCCTT 。3. 如权利要求1所述的鞘脂单胞菌，其特征在于所述鞘脂单胞菌菌抹特 征如下为革兰氏阴性杆菌；无芽孢；直杆状；在营养琼脂平板上菌 落呈乳白色；氧化酶试验阳性；接触酶试验阳性；专性需氧；分解葡 萄糖、果糖、木糖、蔗糖；淀粉水解试验阳性；不能液化明月交；43°C 不生长;菌体大小为1.5 5.0pmx0.8-1.0^im;不产黄色素。'4. 如权利要求1所述的鞘脂单胞菌在微生物发酵制备结冷胶中的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为将所述鞘脂单胞 菌菌抹经活化、种子培养后，接种至适用于鞘脂单胞菌的发酵培养基， 28 32°C、 pH6.8~7.2摇床培养32~60h,获得含有高酰基结冷胶的乳白 色发酵液。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述含有高酰基结冷胶的发酵 液经分离纯化，制得高酰基结冷胶；所述分离纯化方法如下含有高 酰基发酵液调pH值为5.0~6.0,升温至50。C 70。C保温30min 2h后，...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴雪昌，吴荣明，李欧，朱亮，陈亚敏，钱朝东，陈梅，
申请(专利权)人：浙江大学，浙江中肯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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