鞘氨醇单胞菌T‑3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法技术

鞘氨醇单胞菌T‑3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法。所述鞘氨醇单胞菌株(Sphingomonas sp.)T‑3，保藏号为CGMCC No.10150。该发明专利技术方法包括：首先将菌株T‑3活化培养，并接种至种子培养基中，然后将种子液接种至发酵培养基中培养，发酵结束后经蒸馏水稀释，加热，膜分离上清液和菌体沉淀。上清液用盐酸调节pH至3.0左右，得到沉淀用NaOH调至pH中性，烘干得生物多糖。菌体沉淀经烘干后用氯仿抽提，上清经烘干得到聚β羟基丁酸。本发明专利技术所用的菌株T‑3在发酵时，胞内大量积累聚β羟基丁酸，同时向培养基中分泌大量生物多糖，所得两种产物可广泛应用于工业，食品，医疗等领域。

【技术实现步骤摘要】
鞘氨醇单胞菌T-3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法
本专利技术属于生物技术和生物材料领域，具体涉及利用微生物发酵的方法同时合成生物多糖和聚β羟基丁酸的方法。
技术介绍
鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp)是根据16srRNA序列，呼吸醌种类和细胞极性脂模式等特征提出的一个新属。区别于其它革兰氏阴性菌的重要特征是其细胞膜中含有鞘糖脂，而无脂多糖。鞘氨醇单胞菌属广泛分布于水体，土壤和空气中。目前，对于鞘氨醇单胞菌属的研究主要集中在该菌属具有降解难降解有机污染物的能力，比如二苯呋喃可被Sphingomonassp.RW1作为唯一的碳源物质利用；具有合成β胡萝卜素的能力；具有合成一类酸性的荚膜多糖的能力，这些荚膜多糖的结构相似但不尽相同，其统称为鞘氨醇胶。目前，已经大量生产并广泛应用的鞘氨醇胶主要包括：SphingomonaselodeaATCC3161合成的结冷胶，Sphingomonassp.ATCC31555合成的韦兰胶，Sphingomonassp.ATCC53159合成的迪特胶，Sphingomonassp.ATCC31961合成的鼠李胶等。此类鞘氨醇胶具有相对保守的主链结构，而侧链基团的种类、位置则具有极大的多样性，这使鞘氨醇的结构和功能更加丰富，从而赋予了每一种鞘氨醇胶独特的物理性质。比如没有糖基侧链的结冷胶能形成凝胶，从而在食品、日化和医学上得到了广泛的应用；具有鼠李糖或甘露糖侧链的韦兰胶，能形成耐酸、耐碱、耐高温的高粘度的溶液，具有一个或两个鼠李糖侧链的迪特胶在低浓度条件下即可形成高粘度的溶液，在建筑、钻井、采油等高
应用广泛；随着生物技术的发展，越来越多的可产鞘氨醇胶的菌株被鉴定，而这些新发现的天然聚合物资源在未来的生物胶应用中必将发挥更加重要的作用。聚β羟基丁酸是微生物在营养不均衡条件下(如碳源过剩、而其它的氮、磷、硫源限制)积累在体内作为其营养和能量储存物质参与细胞代谢的天然产物。而聚β羟基丁酸的生产主要靠优化纯菌株生产条件，重组大肠杆菌过量表达以及活性污泥中微生物菌群合成来得到，目前，可用于生产聚β羟基丁酸的菌属主要有产碱杆菌属，芽孢杆菌属等。聚β羟基丁酸具有良好的生物降解性，其分解产物可全部为生物利用，对环境无污染，是一种可完全分解的热塑性塑料。同时，作为一种生物合成材料，还具有生物相容性、压电性、抗凝血性、密度大、光学活性好和透氧性低等优点，可望在电子、光学、生物医学等高
获得应用。目前，还没有关于共同生产生物多糖和聚β羟基丁酸的报道。尽管在SphingomonaselodeaATCC3161发酵结冷胶和Sphingomonassp.ATCC53159发酵迪特胶的过程中，有少量的聚β羟基丁酸在菌体内产生，但是在生产中，人们却利用化学突变的方法筛选到了不产聚β羟基丁酸的SphingomonaselodeaATCC3161和Sphingomonassp.ATCC53159的突变菌株，使其更高效的专一的生产结冷胶和迪特胶。主要原因是因为：首先这两株菌中聚β羟基丁酸的产量较低；其次，结冷胶和迪特胶与聚β羟基丁酸的分离需要经过稀释，膜分离的过程，分离后稀释发酵液中结冷胶和迪特胶的提取需要多倍稀释发酵液体积的乙醇提取，成本很高；同时，少量聚β羟基丁酸的存在影响了结冷胶和迪特胶的特性，限制了结冷胶和迪特胶的应用。在工业生产中如果有一株能同时大量生产生物多糖和聚β羟基丁酸的菌株，且两种产物能简单有效的分离，同时具有低成本的提取方法，那么这两种产物的共同发酵则会极大地降低生产成本，减少生物多糖和聚β羟基丁酸单独发酵造成的资源浪费，促进两种产物的工业化生产应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株可同时大量生产生物多糖和聚β羟基丁酸的鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.T-3。本专利技术的第二个目的是提供利用鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.T-3发酵同时大量生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法。两种产物分离方法简单，提取成本低，减少了生物多糖和聚β羟基丁酸单独发酵造成的资源浪费，促进两种产物的工业化生产应用。本专利技术所提供的菌株Sphingomonassp.T-3分离自土壤，在固体平板上表现为菌落成圆形凸起，边缘整齐湿润、粘稠、乳白色。革兰氏呈阴性。利用超薄切片技术处理发酵初期和发酵末期的菌株，在投射电镜下可看到生物多糖广泛分布于胞外，而胞内则充满了白色的聚β羟基丁酸颗粒(图1)。根据16SrDNA序列(见序列表)，将其命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.T-3。该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCCNo.10150，保藏日期为2014年12月10日。本专利技术所述共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法包括：(1)将鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24小时；(2)将步骤(1)制得的培养液以1％的接种量接种至100或300ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；(3)以10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至玻璃摇瓶或发酵罐中，30℃，恒定pH7.2，培养72小时；(4)将步骤(3)的发酵液用蒸馏水至少5倍体积稀释，90～105℃加热15分钟，膜分离发酵液和菌体沉淀；(5)将步骤(4)中膜分离后的上清液用稀盐酸调节pH至3.0得到果冻状沉淀，沉淀经NaOH调节至pH中性，将调节至pH中性的沉淀烘干得到生物多糖；(6)将步骤(4)中的菌体沉淀经烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速离心5分钟，上清液经60℃烘干除去氯仿，得到聚β羟基丁酸；其中：TPG液体培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉浸粉3g/L；种子培养基：蔗糖10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母粉1.5g/L，K2HPO42.5g/L，MgSO40.1g/L，pH7.0；发酵培养基：葡萄糖30～50g/L，豆饼粉0.5～2g/L，K2HPO41～2g/L，MgSO40.1～1g/L，NaNO31～2g/L，pH7.0。本专利技术方法生产的生物多糖具有明显的增稠作用，良好的剪切稀释性能和耐温、耐酸碱和抗盐性能，生物乳化性能以及成凝胶特性，可应用于建筑，食品，医疗，钻井和采油等高
生产的聚β羟基丁酸作为一种生物可降解材料，可应用于电子、光学和生物医学等高
本专利技术的优点和积极效果：鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.T-3可同时高效发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸。胞外产物生物多糖与胞内聚合物聚β羟基丁酸的积累均倾向于利用相同的高C/N比的条件。两者分离提取工艺简单、成本较低。分离后的上清液可利用低成本的酸沉法提取，沉淀则用来提取聚β羟基丁酸。因此，共同发酵生物多糖和聚β羟基丁酸可充分利用资源、底物，具有很好的工业价值。附图说明图1是鞘氨醇单胞菌属Sphingomonassp.T-3发酵初期和发酵末期的超薄切片分析。胞内的白色颗粒为聚β羟基丁酸颗粒，而胞外的纤维状聚合物即为生物多糖。其中A，发酵2h时菌株的透射电镜图；B，发酵72h时菌株的透射电镜图；图2是Sphingomonassp.T-3的进化树；图3是不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)T‑3，其保藏号为CGMCC No.10150，保藏日期为2014年12月10日。

【技术特征摘要】
1.一种鞘氨醇单胞菌T-3发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法，具体方法为：(1)将鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24小时；(2)将步骤(1)制得的培养液以1％的接种量接种至100或300ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；(3)以10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至玻璃摇瓶或发酵罐中，30℃，恒定pH7.2，培养72小时；(4)将步骤(3)的发酵液用蒸馏水至少5倍体积稀释，90～105℃加热15分钟，膜分离发酵液和菌体沉淀；(5)将步骤(4)中膜分离后的上清液用稀盐酸调节pH至3.0得到果冻状沉淀，沉淀经NaOH调节至pH中性，将调节至pH中性的沉淀烘干得到生物多糖；(6)将步骤(4)中的菌体沉淀经烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速离心5分钟，上清液经60℃烘干除去氯仿，得到聚β羟基丁酸；其中：TPG液体培养基：葡萄糖10...

【专利技术属性】
技术研发人员：马挺，吴萌萌，李国强，张文文，陈思彬，周洁芳，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12