本发明专利技术公开了一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，通过采用外源性的活性氮诱导物，以一定的浓度加入到体外培养的内皮细胞中，作用一定时间，造成内皮细胞的损伤，建立一种活性氮损伤内皮细胞的模型。利用该细胞模型，加入不同的药物，通过观察相应的ＲＯＳ、３－ＮＴ生成的情况，细胞的存活率作为靶点，体外筛选可减轻活性氮对内皮细胞损伤的药物。本发明专利技术避免了细胞整体水平筛选的盲目性，减少了工作量且药物作用机制明确，具有直接，快速和简便的优点，适合大规模的心脑血管候选药物筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学和药理学
，涉及一种内皮细胞模型及其建立方法与应用，特别涉及一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，以及基于该模型进行相关药物筛选的应用。
技术介绍
药物筛选模型是寻找和发现好的有治疗作用药物的重要和必要条件。基于特异靶点的分子和细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少，快速灵敏，药物作用机制明确，可实现大规模筛选等特点，是目前药物初筛的主要模式。过去的十几年中，关于活性氮(*NO)对于内皮细胞的作用观点很多，但普遍认为其是一个具有多种生物活性和多面性的小分子物质，对于维持内皮细胞及血管的功能作用巨大。在病理条件下，活性氮一方面可以舒张血管，增加血流量，加速致病因子的清除，同时也可以维持微环境的氧化还原态的稳定。但大量的活性氮对内皮细胞是有损伤作用的，表现在可能引起细胞供能系统线粒体的损伤和活性氧(ROS)的大量释放(Oxidative burst and NO generation asinitial response to ischemia in flow-adapted endothelial cells. Am J Physiol HeartCirc Physiol 280:H2126-2135; 2001.)。活性氮和活性氧可快速结合生成过氧亚硝酸阴离子(ONOCT)，其氧化能力是过氧化氢(H202)的约1000倍，可引起细胞不可逆的损伤，并最终走向凋亡(Walford， G. A.; Moussignac, R. L.; Scribner，A. W.; Loscalzo, J.; Leopold, J. A. Hypoxia potentiates nitric oxide-mediatedapoptosis in endothelial cells via peroxynitrite-induced activation ofmitochondria-dependent and -independent pathways. J Biol Chem 279:4425-4432;2004.)。建立一个活性氮损伤的内皮细胞模型，可以为深入研究病理状态下活性氮对血管内皮细胞的损伤机制提供实验室依据，也可以通过该模型筛选出一些对活性氮的损害有保护作用的药物。但是由于活性氮是一个小分子不稳定的物质，其单独存在的时间极短，若要建立相关细胞模型，就必须选择适当的活性氮作为造模物质。而目前的研究中并没有关于某种活性氮诱导物可以作为明确的活性氮来源，作用内皮细胞产生损伤的文献报道，也没有在体外研究病理条件下建立活性氮对内皮细胞的损伤模型，以及该模型在药理学上应用的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，是将外源性的活性氮诱导物质加入到内皮细胞生长的培养基中，活性氮自然产生，与活性氧结合并作用于内皮细胞，引起相应的包括线粒体损伤，凋亡早期活性氧(ROS)的生成，蛋白酪氨酸硝基化(3-NT)及凋亡，得到活性氮损伤内皮细胞模型。以ROS， 3-NT产生，随时间增加，细胞存活率明显降低的确切特征性标志作为造模成功的评价标准。所述外源性的活性氮诱导物质为s-亚硝酰谷胱甘肽(GSNO)， s-亚硝酰半胱氨酸(CSNO)和3-吗啉-斯得酮亚胺(SIN隱1)。。本专利技术提供的活性氮损伤内皮细胞模型，是经过活性氮作用的体外培养内皮细胞，所述的内皮细胞包括原代培养人脐静脉内皮细胞，大鼠脑血管内皮细胞，小鼠脑血管内皮细胞，牛冠状动脉内皮细胞，永生化人脐静脉来源的EA.hy926细胞系及HUVEC细胞系的内皮细胞。本专利技术提供的活性氮损伤内皮细胞模型的构建方法
本专利技术的第二个目的是提供上述活性氮损伤内皮细胞模型在筛选具有抵抗活性氮损伤作用的心脑血管药物中的应用。针对活性氮引起的内皮细胞损伤是ROS-3-NT-线粒体凋亡依赖性，可以作为筛选具有保护内皮细胞不受活性氮损伤作用的药物靶点。具体方法是通过将待测样品加入活性氮损伤内皮细胞模型中，通过观察相应的ROS、 3-NT生成的情况，细胞的存活率筛选出对该损伤有保护作用的药物。本专利技术提供了外源性的活性氮诱导物质来构建活性氮损伤内皮细胞的药物筛选方法，填补了这类药物筛选模型的空缺。针对这一内皮细胞损伤模型的特征作为靶点进行相关药物筛选开发，避免了细胞整体水平筛选的盲目性，减少了工作量且药物作用机制明确，具有直接，快速和简便的优点，适合大规模的心脑血管候选药物筛选。附图说明图1为不同浓度的GSNO加入到EA.hy926细胞24、 48小时细胞存活率的MTT分析结果。图2为0.5mM GSNO加入到EA.hy926细胞不同时间ROS的生成量。图3为0.5mM GSNO加入到EA.hy926细胞不同时间3-NT的生成量。图4为不同药物对于GSNO损伤的EA.hy926细胞模型中细胞存活率的 MTT分析结果。图5为不同药物对于GSNO损伤的EA.hy926细胞模型中细胞3-NT生成 量的影响。图6为不同药物对于SIN-1损伤的HUVEC细胞模型中细胞存活率的MTT 分析结果。图7为不同药物对于SIN-1引起的HUVEC细胞模型中细胞3-NT生成量 的影响。 具体实施例方式本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。 药品与试剂高糖DMEM培养基购于GIBICO公司，胎牛血清购于杭州四季青公司， 活性氧清除剂Trolox、活性氮清除剂Hemoglobin、 3-NT抗体购于sigma公司， 其它试剂均为国产和进口分析纯试剂。细胞试验所使用的原代培养内皮细胞EA.hy926细胞和HUVEC细胞均购于美 国ATCC细胞库。培养条件5%C02， 37°C，高糖DMEM培养基，培养基每 升含IOOU青霉素和100U链霉素；10°/。国产胎牛血清；37°C (5% C02， 95% 空气)，饱和湿度，待细胞生长至80%左右融合，用胰酶-EDTA液消化后进行 传代，传代密度5xl04/ml隔2天传代；冻存条件2ml冻存管，每管40万 细胞，含70。/。高糖DMEM， 20%国产胎牛血清，10%DMSO。实施例1 GSNO作用于EA.hy926细胞制造活性氮损伤模型并用于药物筛选 取对数生长的EA.hy926细胞，加入适量胰蛋白酶-EDTA消化液，使贴壁 细胞脱落，收集细胞，计数，用含10%胎牛血清的培养液配成细胞悬液 (5xl04/mL)，于96孔板中每孔加入100 |iL，在37。C、 5%(302培养2411。取 GSNO溶于无菌生理盐水中配制成母液为100mmol/L的溶液，0.22pm滤膜过 滤除菌后，加入到细胞培养基中，使终浓度分别为0.1, 0.5， 1， 2mM。以溶 剂为阴性对照，放入培养箱于相同条件下继续培养24或48h。结束培养前4h 力口入MTT(5mg/mL， D-Hanks，溶解)10pL，试验结束时吸去上清，加入150pL DMSO，用酶联免疫检测仪于570 nm处测定各孔OD值，记录结果，取6孔 OD值求均值，计算抑制率抑制率(IR%) =(l-TOD/COD)xl00%。试验结果如图1所示，可见0.5mM-2mM浓度的GSNO作用24或48H都可以使EA.hy926 细胞存活率明显降低。经计算0.5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，通过以下步骤实现：将外源性的活性氮诱导物质加入到内皮细胞生长的培养基中，活性氮自然产生，与活性氧结合并作用于内皮细胞，引起线粒体损伤，凋亡早期活性氧的生成，蛋白酪氨酸硝基化及凋亡，得到活性氮损伤内皮细胞模型，以凋亡早期活性氧，蛋白酪氨酸硝基化产生，细胞存活率明显降低的确切特征性标志作为建模评价标准。
【技术特征摘要】
1.一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，通过以下步骤实现将外源性的活性氮诱导物质加入到内皮细胞生长的培养基中，活性氮自然产生，与活性氧结合并作用于内皮细胞，引起线粒体损伤，凋亡早期活性氧的生成，蛋白酪氨酸硝基化及凋亡，得到活性氮损伤内皮细胞模型，以凋亡早期活性氧，蛋白酪氨酸硝基化产生，细胞存活率明显降低的确切特征性标志作为建模评价标准。2. 根据权利要求1所述的内皮细胞模型，其特征在于所述外源性的活 性氮诱导物质...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩峰，楼宜嘉，刘启兵，刘璐璐，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[]
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