本发明专利技术涉及一种简便、快速的微生物分离方法，尤其是一种快速分离稻曲病菌的方法，属于微生物技术领域。该方法将稻曲球在无菌水中刮洗除去稻曲球表层的杂菌，再用７５％的乙醇溶液消毒３０～６０ｓ、０．１％升汞水溶液浸泡消毒２～４ｍｉｎ，用无菌水清洗，然后加入无菌水捣碎，用捣碎液冲洗分离用胁本哲氏培养基，风干培养基表面水份后，将培养皿置于恒温箱２８℃中黑暗培养，培养第６天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落及白色菌丝移至培养用胁本哲氏培养基中纯化培养１０天，再将稻曲病菌移至ＰＳＡ斜面培养基中培养１０天后即可得到相应的稻曲病菌。本发明专利技术在短期内可从稻曲球中大量、快速、有效地分离出稻曲病菌，能有效解决稻曲病菌其它分离法中存在的污染、耗时、可靠性差、纯化难度大等问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种简便、快速的微生物分离方法，尤其是一种快速分离稻曲病菌的 方法，属于微生物
技术介绍
水稻稻曲病是一种世界性水稻真菌病害，为害水稻穗部，有性态为子囊菌门 麦角菌属稻麦角菌(Clavic印s oryzaesativae Has.)，无性态为半知菌门绿核菌属 (Ustilaginoideavirens(Cooke)Takahashi)，在亚洲、非洲和美洲等许多国家和地区都有 发生。稻曲病不但危害水稻，影响产量与米质，而且混杂于病稻谷中的稻曲球及病菌含有对 人畜有剧毒作用的毒素，现已成为水稻生产上的重要病害。感染稻曲病菌的颖谷，随着白色菌丝的发育，病粒逐渐膨大，从内外颖合缝处向外 伸出白色舌状物，此白色舌状物以较快的速度向顶端和两侧膨胀，使内外颖张开，病菌的厚 垣孢子不断产生，孢子座逐渐膨大，外膜破裂，稻曲形成。稻曲颜色初为桔黄色，以后变为暗 绿色和墨绿色，最后变为黑色。北方稻曲病粒上有菌核存在，菌核表面黑色，形状多变，但全 形呈扁平状，未成熟菌核埋在病粒内侧，成熟后约5天外露易脱落。稻曲病菌属于一种寄生性较强腐生性较弱的真菌，稻曲球营养丰富，常伴生大量 的腐生细菌和真菌及其它病原菌，加之该菌生长缓慢，培养过程中极容易污染，故分离成功 率很低。目前稻曲病分离的方法有稻曲球厚垣孢子悬液法、稻曲球组织分离法、菌核分离 法及新鲜稻曲球抖落法，其中稻曲球内层组织分离法多被稻曲病研究者所采用。然而在众 多研究人员实际操作过程中，普遍发现采用稻曲球内层组织分离法虽可分离到稻曲病菌， 但其培养时间较长，分离速度较慢，成功率较低，因其常伴随其它杂菌如细菌、真菌及类似 稻曲病菌的杂菌如稻黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)的出现，影响稻曲病菌进一步分离和 纯化的效果。厚垣孢子悬液法，因混于培养基中的厚垣孢子须萌发成菌丝穿过培养基，延 长了厚垣孢子形成单菌落的时间，易导致生长速度过快的杂菌覆盖于少量馒头状的单菌落 上，加大分离纯化的难度。孢子振落法，由于稻曲表面不作消毒处理，稻曲表面大量的杂菌 易在培养基表面快速生长，影响厚垣孢子萌发、生长及菌落的纯化。稻曲病菌菌核分离法因 南方稻区少见，采用此法对研究南方稻曲病菌菌群意义不大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简便的稻曲病菌快速分离方法，该方法在短期内可从 稻曲球中大量、快速、有效地分离出稻曲病菌，为稻曲病菌的人工培养、接种技术、病菌分化 变异、抗病品种筛选和遗传机制等方面的研究奠定基础。本专利技术的目的是通过如下步骤来实现(1)稻曲球标样选择选取从田间采集的新鲜黄色稻曲球或4°C冰箱中保存2个月 内的稻曲球；(2)单粒稻曲球消毒在无菌水中刮洗除去稻曲球表层的杂菌5次，再用75% (重 量)的乙醇溶液消毒30 60s、0. (重量)升汞水溶液浸泡消毒2 4min和无菌水清 洗3次；(3)稻曲球捣碎液制备单粒稻曲球在无菌培养皿和4mL的无菌水中，用无菌手术 刀捣碎消毒好的稻曲球组织后，制备含厚垣孢子和组织碎块的稻曲球捣碎液；(4)稻曲球捣碎液冲洗平板用移液枪吸取lrnL捣碎液冲洗分离用胁本哲氏培养 基表面，随后用移液枪吸去残余的捣碎液；(5)稻曲病菌分离无菌通风条件下风干培养基表面水份后，将培养皿置于恒温 箱28°C中黑暗培养，逐日观察分离结果；(6)稻曲病菌纯化培养第6天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落及白色菌丝 移至培养用胁本哲氏培养基中纯化培养10天；(7)稻曲病菌保存依据病菌在培养基的生长特性及其显微观察结果，将稻曲病 菌移至PSA斜面培养基中培养10天后，保存于4°C冰箱中。本步骤(4)中分离用胁本哲氏培养基配方为马铃薯300g、蛋白栋5g、蔗糖15g、 Ca(N03)2 4H20 0. 5g、Na2HP04 12H20 2. 0g、琼脂 16g、加水定容至 lOOOmL，在 121°C下高压 湿热灭菌20 25min，待培养基冷却至45°C 50°C时加入抑制细菌生长的氯霉素(50 y g/ ml)混勻，倒入培养皿中凝固后备用。本步骤(6)中培养用胁本哲氏培养基配方为马铃薯300g、蛋白陈5g、蔗糖 15gCa(N03)2 .4H20 0. 5g、Na2HP04 12H202. 0g、琼脂 16g、加水定容至 lOOOmL，步骤(7) PSA 固 体培养基配方为马铃薯200g、琼脂20g、蔗糖20g、加水定容至1000mL。采用本专利技术对于粉虱寄生菌痤壳孢菌(Aschersonia aleyrodis)(从柑桔叶片中 采集)的分离也较适用。本专利技术是在稻曲球厚垣孢子悬液法和稻曲球组织分离法基础上，综合利用两者的 分离特性，而提供一种简便、快速、有效的稻曲病菌分离法，能有效解决稻曲病菌其它分离 法中存在的污染、耗时、可靠性差、纯化难度大等问题，具有方便、快捷、省材、可靠性好等优点o具体实施例方式实施例1(1)稻曲球标样来源选取从田间采集的新鲜黄色稻曲球(附图1)。(2)培养基配制A 分离用的培养基采用胁本哲氏培养基马铃薯300g、蛋白栋5g、蔗糖15g、 Ca(N03)2 4H20 0. 5g、Na2HP04 12H20 2. 0g、琼脂 16g、加水定容至 lOOOmL，在 121°C下高压 湿热灭菌20 25min，待培养基冷却至45°C 50°C时加入抑制细菌生长的氯霉素(50 y g/ ml)混勻，倒入培养皿中凝固后备用。B 培养用的培养基采用胁本哲氏培养基、PSA固体培养基、PS液体培养基。其中 培养用胁本哲氏培养基配方如A所述，但不含氯霉素。PSA固体培养基为马铃薯200g、琼 脂20g、蔗糖20g、加水定容至lOOOmL。PS液体培养基为马铃薯200g、蔗糖20g、加水定容至1000mL。以上培养基均在121°C下高压湿热灭菌20min后备用。(3)稻曲球消毒单粒稻曲球在无菌水中用灭菌的手术刀刮洗除去稻曲球表层的杂菌5次，留中层 黄色稻曲球组织，再用75%的酒精消毒30s、0. 升汞浸泡消毒2min，最后再用无菌水清 洗3次(附图3)。(4)稻曲球组织捣碎液制备消毒好的稻曲球置于培养皿中(d = 5cm)，每粒稻曲球加无菌水4mL，用无菌手术 刀捣碎后，即为组织捣碎液(内含厚垣孢子和组织碎块)。注意每粒稻曲单独制液，以免相 互感染(附图4)。(5)稻曲球捣碎液冲洗平板用移液枪吸取不同浓度的捣碎液lmL(含组织碎块)冲洗于含胁本哲氏培养基的 培养皿中(d = 9cm)，使培养基表面有捣碎液覆盖和组织碎块分散，随后吸去残余的捣碎 液，每个浓度处理4个平板(附图5)。(6)稻曲病菌分离打开培养皿皿盖，置于操净工作台上，并在通风状态和无菌条件下风干培养基表 面水份(附图6)，风干后的培养皿置于28°C恒温箱中，在黑暗条件下培养，逐日观察分离结^ o(7)稻曲病菌纯化病菌培养第4天后，在胁本哲氏培养基表面上如有大量生长速度较快的菌落出 现，视为杂菌感染皿，如无任何菌落出现，视为有用皿，继续培养第6天后发现，出现较多分 布均勻、形态清晰、优势性明显的黄色或白色小菌落，分散于培养基的部份组织碎块上也出 现了疑似稻曲菌的白色菌丝，视为有效皿(附图7 8)，此时用尖头挑针小心挑取小菌落和 组织块上的白色菌丝本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种简便的稻曲病菌快速分离方法，其特征在于：按照以下步骤进行 （１）稻曲球标样选择：选取从田间采集的新鲜黄色稻曲球或４℃冰箱中保存２个月内的稻曲球； （２）单粒稻曲球消毒：在无菌水中刮洗除去稻曲球表层的杂菌５次，再用７５％（重量）的乙醇溶液消毒３０～６０ｓ、０．１％（重量）升汞水溶液浸泡消毒２～４ｍｉｎ和无菌水清洗３次； （３）稻曲球捣碎液制备：单粒稻曲球在无菌培养皿和４ｍＬ的无菌水中，用无菌手术刀捣碎消毒好的稻曲球组织后，制备含厚垣孢子和组织碎块的稻曲球捣碎液； （４）稻曲球捣碎液冲洗平板：用移液枪吸取１ｍＬ捣碎液冲洗分离用胁本哲氏培养基表面，随后用移液枪吸去残余的捣碎液； （５）稻曲病菌分离：无菌通风条件下风干培养基表面水份后，将培养皿置于恒温箱２８℃中黑暗培养，逐日观察分离结果； （６）稻曲病菌纯化：培养第６天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落及白色菌丝移至培养用胁本哲氏培养基中纯化培养１０天； （７）稻曲病菌保存：依据病菌在培养基的生长特性及其显微观察结果，将稻曲病菌移至ＰＳＡ斜面培养基中培养１０天后，保存于４℃冰箱中。
【技术特征摘要】
一种简便的稻曲病菌快速分离方法，其特征在于按照以下步骤进行(1)稻曲球标样选择选取从田间采集的新鲜黄色稻曲球或4℃冰箱中保存2个月内的稻曲球；(2)单粒稻曲球消毒在无菌水中刮洗除去稻曲球表层的杂菌5次，再用75％(重量)的乙醇溶液消毒30～60s、0.1％(重量)升汞水溶液浸泡消毒2～4min和无菌水清洗3次；(3)稻曲球捣碎液制备单粒稻曲球在无菌培养皿和4mL的无菌水中，用无菌手术刀捣碎消毒好的稻曲球组织后，制备含厚垣孢子和组织碎块的稻曲球捣碎液；(4)稻曲球捣碎液冲洗平板用移液枪吸取1mL捣碎液冲洗分离用胁本哲氏培养基表面，随后用移液枪吸去残余的捣碎液；(5)稻曲病菌分离无菌通风条件下风干培养基表面水份后，将培养皿置于恒温箱28℃中黑暗培养，逐日观察分离结果；(6)稻曲病菌纯化培养第6天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落及白色菌丝移至培养用胁本哲氏培养基中纯化培养10天；(7)稻曲病菌保存依据病菌在培养基的生长特性及其显微观察结果，将稻曲病菌移至PSA斜面培养基中培...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀娟，杜宣新，何玉仙，陈福如，甘林，阮宏椿，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]
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