本发明专利技术涉及一种猪口蹄疫苗用的、由ＣｐＧ基序和猪ＩＦＮ－γ基因克隆入真核表达载体构成的佐剂及其制造方法，以及猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗与这种佐剂配伍而成猪口蹄疫苗组合物。本发明专利技术的这种复合分子型佐剂，其ＣｐＧ基序为至少由３个ＧＴＣＧＴＴ、２个ＧＡＣＧＴＴ和１个ＡＡＣＧＴＴ特殊序列构成的一段基序，其序列为ＳＥＱ?Ｎｏ：１，用其构建的ＰｃＤＮＡ３．１重组质粒，并在大肠杆菌中增殖。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪口蹄疫苗用的佐剂及其制造方法，更具体地说，涉及一种利用 基因工程技术生产的复合分子型佐剂，以及猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗与这种佐剂配伍而 成猪口蹄疫苗组合物。本专利技术的这种佐剂是由CpG基序和猪IFN-Y基因克隆入真核表达 载体构成。
技术介绍
自从上世纪20年代以来，许多物质被尝试作为免疫佐剂，但只有铝胶获得了人类 疫苗佐剂的许可，并大量用于动物疫苗。它作为抗原的储存库和载体，缓慢释放抗原延长诱 导机体的体液免疫反应，但缺点是仅诱导Th2体液免疫反应，抗体以IgGl型为主，无TCL反 应；油佐剂和弗氏完全佐剂虽能明显提高免疫应答能力，但在实际应用中常出现不良反应， 如注射部位肿胀、疼痛、发烧，或发生过敏等，仅限用于实验室内动物试验；206佐剂是目前 商品化的高效动物疫苗油佐剂，已广泛使用于动物疫苗中，实践证实是可靠的、有效的和安 全的，但需要进口，价格较高。CpG基序已经报道的有三种类型(Klinman，et al，2004)。传统的CpG ODN也叫做 K型CpG ODN或是B型CpG 0DN，可以活化B细胞和诱导巨噬细胞产生细胞因子。D型CpG 0DN,也叫做A型CpG，其活化B细胞与巨噬细胞能力较弱，但具有较强的诱导浆细胞样树突 状细胞产生I型干扰素的能力。C型CpG ODN可以诱生I型干扰素，以及活化B细胞等功能。 它由多个CpG基序重复的硫代磷酸骨架和5’端的TCG 二聚体所组成。CpG基序能够刺激机 体的免疫系统产生免疫应答，主要是由于免疫细胞具有能够识别CpG基序的受体结构。目 前CpG ODN在免疫增强效应方面的研究已取得了一定的进展。非甲基化CpG基序的免疫 增强作用已被许多研究所证实，含非甲基化的CpG寡核苷酸序列(简称CpG 0DN)能使B、 T细胞激活，同时增强机体的特异性细胞免疫和体液免疫，它能诱导强烈的Thl型反应，以 IgG2a型为主，有TCL反应，同时能与铝胶等其他佐剂配伍使用，有较好的协同作用(Risini D. W, M J. McCluskie, Yu Xu, et al. CpG DNA induces stronger immune responses with less toxicity than other adjuvant. Vaccine, 2000,18 :1755_1762)。中国专利技术专利200410033878. 1公开的一种新型免疫佐剂，其主要成分是从卡介 苗菌中提取的CpG-DNA，其为富含CpG基序的DNA。该佐剂为免疫刺激型佐剂，本身具有免 疫活性作用，在体内诱导的是Thl型免疫应答，可作为治疗与预防用疫苗佐剂。中国专利技术专利200310106226. 1公开的能促进畜禽疫苗效价的用作 畜禽疫苗佐剂的CpG DNA的基因工程重组体，该基因工程重组体是根据由 序列为5' -GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3'、5' -GGTGCGTCGATGCAGGGGGG-3'及 5，-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT—3，串联而成的D 19D282006目的片段DNA的序列，合成其 寡核苷酸正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线形载体末端相匹配的碱基序列， 然后将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、及无菌重蒸水混合后，于90°C 100°C水浴中孵浴3 分钟以上，自然冷却至室温，形成含D19D282006序列的DNA片段，此后将此DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组体。IFN- Y是由Thl细胞和NK细胞分泌的多功能细胞因子，具有广谱的抗病毒活性， 对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用。发现IFN除具有抗病毒、抗肿瘤活性以 外，还有强大的免疫调节活性，通过刺激细胞表达MHC I类分子和II类分子增强免疫反应。 近年来，随着研究的深入，人们发现以重组IFN-Y为疫苗佐剂，不仅能特异性的增强疫苗 的免疫效果，而且可增强机体抗感染的能力。Schijns等用IFN-Y对狂犬病灭活苗免疫 的增强效果，结果表明IFN-Y对该疫苗免疫佐剂作用相当，可使疫苗达到50%保护的稀释 倍数提高50倍，当标准疫苗做1 10000稀释时，仍可有效提高机体免疫保护力(Schijns VECJ, 1994)。Virgil等(2002)用狂犬病毒和杯状病毒与表达猫IFN- γ的重组杆状病毒免 疫猫，结果发现IFN-Y可促进抗体的产生，增强抗原的特异性抗体水平，人IFN-Y作为乙 肝疫苗佐剂也能增强抗体的水平。中国专利技术专利200510119720.0公开的一种猪疫苗使用的基因佐剂，其特征在于 重组表达质粒中含有猪Y-干扰素基因(PlFN-Y)，在动物细胞中表达后发挥免疫增强作 用。但这种佐剂的免疫增强作用类型单一、程度有限，成本相对较高。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足，有更高安全性和高效、廉价的猪口蹄疫苗 用的复合分子型佐剂，以及这种佐剂的制造方法，同时提供一种使用这种佐剂的猪口蹄疫 苗组合物。本专利技术的这种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂是由CpG基序和猪IFN-Y基因克 隆入真核表达载体构成的重组质粒。本专利技术的猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其CpG基序为至少由3个GTCGTT、2个 GACGTT和1个AACGTT特殊序列构成的一段基序，其序列为SEQ No :1，用其构建的PcDNA3. 1 重组质粒，并在大肠杆菌中增殖。本专利技术的猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂是由CpG基序构建的重组质粒，其序列 为 SEQ No :2ο本专利技术的猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，所用的猪IFN-Y基因为含信号肽的 序列，其序列为SEQ No :3，用其构建的PcDNA3. 1重组表达质粒，使IFN-γ基因处在启动子 的下游、CpG序列的上游，并能在哺乳动物细胞中表达。本专利技术的猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂的制备方法是人工设计、合成一段基本 骨架由3个GTCGTT、2个GACGTT和1个AACGTT所构成的CpG基序以及其配对序列，同时在 其5’端分别设计EcoRI和Xhol酶切位点的部分碱基，并使其成为双链DNA，通过基因重组 方法构建到经EcoRI和Xhol酶切的真核表达载体中，获得含CpG基序的重组质粒；然后利 用猪 IFN-Y 特异引物上游引物5，端CCCAAGCTTACAATGGGTTATACAACTACTTATTTCT Hid III ；下游 5，端GGAATTCTTATTTTGATGCTCTCTGGCCT EcoR I，在 pGEM-Teasy-pIFN-γ 重组 质粒，参见“猪IFN-Y基因的克隆与序列分析”窦永喜、景志忠等，《中国兽医科技》2003， 33(9) :11_15，上克隆pIFN-γ基因片段扩增获得IFN-γ基因，再分别将含CpG基序的重组 质粒和IFN- γ基因经相应的酶切后连接，得到PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重组质粒。本专利技术的猪口蹄疫苗用复合分子型佐剂制备方法中，首先将构建的PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重组质粒转化到大肠杆菌，再用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提 取重组质粒测序鉴定后，选择高拷贝的阳性菌株，接种到含氨苄的LB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征在于这种佐剂是由ＣｐＧ基序和猪ＩＦＮ－γ基因克隆入真核表达载体构成的重组质粒。
【技术特征摘要】
一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征在于这种佐剂是由CpG基序和猪IFN γ基因克隆入真核表达载体构成的重组质粒。2.权利要求1所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征在于CpG基序为至 少由3个GTCGTT、2个GACGTT和1个AACGTT特殊序列构成的一段基序，其序列为SEQ No 1，用其构建的PcDNA3. 1重组质粒，并在大肠杆菌中增殖。3.权利要求2所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征是由CpG基序构建 的重组质粒，其序列为SEQ No :2。4.权利要求3所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂，其特征在于所用的猪 IFN-y基因为含信号肽的序列，其序列为SEQ No :3，用其构建的PcDNA3. 1重组表达质粒， 使IFN-y基因处在启动子的下游、CpG序列的上游，并能在哺乳动物细胞中表达。5.权利要求2-4所述的一种猪口蹄疫苗用的复合分子型佐剂的制备方法，其特征在于 人工设计、合成一段基本骨架由3个GTCGTT、2个GACGTT和1个AACGTT所构成的CpG基序 以及其配对序列，同时在其末端分别设计EcoRI和Xhol酶切位点的部分碱基，并使其成为 双链DNA，...
【专利技术属性】
技术研发人员：景志忠，陈国华，房永祥，窦永喜，蒙学莲，赵娜，曾爽，贾怀杰，才学鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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