【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物成像，具体涉及flipgfp探针、新冠病毒靶点荧光探针及其应用。
技术介绍
1、
2、由于病毒频繁的突变和变异，致使目前疫苗失去效果。针对新冠病毒(sars-cov-2)设计并开发有效药物是全世界迫在眉睫的事情。因此新冠的有效药物的市场前景是不可估量的。
3、新冠病毒主要蛋白酶(3clpro)是病毒关键靶点，参与了非结构蛋白的切割加工，另一方面病毒切割宿主蛋白也是重要的致病机制。美国东部时间2021年11月5日，辉瑞宣布其新冠口服药物paxlovid治疗新冠病毒感染引起的肺炎非住院患者的2/3期epic-hr试验中期分析结果，对比安慰剂组，paxlovid可将新冠病毒感染引起的肺炎非住院患者的住院或死亡率降低89％。因此将新冠主要蛋白酶3clpro作为药物靶点是安全的。
4、新冠木瓜蛋白酶(plpro)在复制和包装新一代病毒过程中起主要作用的蛋白酶，也是新冠病毒的主要药物靶点。
5、目前新冠病毒的药物发现面临两大困难：
6、(1)病毒的突变是最难控制的部分，rna病毒频繁的突变常常使病毒产生耐药性，因此研发病毒多靶点抑制剂是有效抵抗病毒变异的方法。
7、(2)目前很多新冠病毒的药物筛选需要用到p3级别的实验室，需要专业的场地和训练有素的实验员，操作复杂，让高通量药物筛选受到很多限制。因此开发简便易行的高通量新冠病毒抑制剂筛选方法是迫在眉睫的事情。
技术实现思路
1、本专利技术针对上述现有技术存
2、具体技术方案如下：
3、本专利技术的目的之一是提供一种flipgfp探针，其按顺序依次包括编码以下蛋白质或肽段的dna序列：β10、e5、β11、cleave seq、k5、β1～9；
4、其中，编码β10的dna序列如seq id no.1所示；
5、其中，编码β11的dna序列如seq id no.4所示；
6、其中，编码β1～9的dna序列如seq id no.8所示；
7、其中，e5和k5为a-helix结构的肽。
8、本专利技术的flipgfp探针基于flip gfp技术，原理如下：将gfp拆分成三个片段，β1～9，β10，β11。用两个a-helix结构的小肽e5、k5将β11封闭住，使β11不能插入到β1～9之中，所以不能形成完整的绿色荧光蛋白gfp，细胞中没有荧光。以flipgfp探针作为探针骨架，将蛋白酶的protease的特异的剪切片段插入到k5和β11之间，当细胞内的蛋白酶被激活的时候会来切开这段片段，这时β11就会被释放出来与β1～9，β10形成完整的gfp蛋白，细胞中显示出绿色荧光。该探针的荧光信号激活之后可以提升几十倍，荧光强度相当于全长gfp的80％。
9、本专利技术利用上述flipgfp探针将新冠病毒水解酶的主蛋白酶3clpro和plpro的特异性的酶切序列放入flip gfp的k5和β11之间，就形成了双靶点活性检测探针。
10、优选地，编码e5的dna序列如seq id no.3所示。
11、优选地，编码k5的dna序列如seq id no.6所示。
12、优选地，水解肽序列cleave seq为caspase3 cleave seq，编码caspase3cleaveseq的dna序列优选如seq id no.5所示。可将新冠病毒水解酶的特异性水解肽段插入cleave seq中，即可得到相应的水解酶探针。
13、优选地，k5与β1～9之间还包括t2a。编码t2a的dna序列具体如seq id no.7所示。t2a保证真核表达质粒在细胞内翻译成两个完整的部分并保证表达量是1：1的比例。
14、优选地，β1～9之后还包括t2a-mcherry。从定量的角度，mcherry的荧光亮度可作为探针的内参。编码mcherry的dna序列具体如seq id no.9所示。
15、优选地，β10、e5之间还包括linker(连接器)。编码linker的dna序列优选如seq idno.2所示。
16、进一步优选，所述的flipgfp探针按顺序包括编码以下蛋白质或肽段的dna序列：β10-linker-e5-β11-cleave seq-k5-t2a-β1～9-t2a-mcherry。
17、本专利技术的目的之二是提供上述flipgfp探针在检测新冠病毒水解酶底物特异性中的应用。
18、具体地，可将新冠病毒水解酶的待验证特异性水解肽序列段插入cleave seq中，然后克隆至表达载体；将编码新冠病毒靶点水解酶3clpro或plpro的dna序列克隆至表达载体；将两者均转染至细胞，转染后(优选转染16～24小时后)，成像，根据荧光强度(gfp荧光强度/mcherry荧光强度)判断底物的特异性。比值越大，底物特异性越强。可使用高内涵软件(thermo scientific hcs studio：cellomics scan version 6.6.0)自动分析成像结果，实现定量。
19、具体地，编码3clpro的dna序列如seq id no.11所示。
20、具体地，编码plpro的dna序列如seq id no.12所示。
21、优选地，克隆入新冠病毒靶点水解酶表达载体的序列还包括bfp(蓝色荧光蛋白)，具体为bfp-3clpro或bfp-plpro。
22、具体地，编码bfp的dna序列如seq id no.10所示。
23、其中，所述的细胞优选为293t细胞。
24、其中，所述的表达载体优选为真核表达载体pcdna3.1。
25、本专利技术的目的之三是提供一种新冠病毒靶点荧光探针，所述的新冠病毒靶点荧光探针使用上述flipgfp探针制备。将编码3clpro的特异性底物的dna序列和/或编码plpro的特异性底物的dna序列插入编码cleave seq的dna序列中。
26、优选地，将编码3clpro的特异性底物的dna序列和编码plpro的特异性底物的dna序列融合，并插入编码cleave seq的dna序列中，可得到同时可以检测3clpro和plpro两个水解酶活性的双靶点探针。进而可以用于筛选可以抑制sars-cov-2的两个病毒主水解酶3clpro和plpro的药物。双靶点抑制剂可以大大加速药物筛选的速度，并且可有效抵抗新冠病毒的变异速度。该设计是本专利技术的主要价值所在。
27、其中，编码3clpro的特异性底物的dna序列如seq id no.13～15中的一种所示，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.FlipGFP探针，其特征在于，按顺序依次包括编码以下蛋白质或肽段的DNA序列：β10、E5、β11、cleave seq、K5、β1～9；
2.根据权利要求1所述的新冠病毒靶点荧光探针，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的新冠病毒靶点荧光探针，其特征在于，
4.如权利要求1～3任一项所述的FlipGFP探针在检测新冠病毒水解酶底物特异性中的应用。
5.新冠病毒靶点荧光探针，使用如权利要求1～3任一项所述的FlipGFP探针制备，其特征在于，将编码3CLpro的特异性底物的DNA序列和/或编码PLpro的特异性底物的DNA序列插入编码cleave seq的DNA序列中。
6.根据权利要求5所述的新冠病毒靶点荧光探针，其特征在于，
7.如权利要求5或6所述的新冠病毒靶点荧光探针在筛选新冠病毒抑制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用于针对新冠病毒的靶点3CLpro和PLpro的抑制剂筛选。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，抑制剂的筛选方法包括：>
10.Artesunate、Bortezomib和Ixazomib Citrate中的至少一种在制备新冠病毒抑制剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.flipgfp探针，其特征在于，按顺序依次包括编码以下蛋白质或肽段的dna序列：β10、e5、β11、cleave seq、k5、β1～9；
2.根据权利要求1所述的新冠病毒靶点荧光探针，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的新冠病毒靶点荧光探针，其特征在于，
4.如权利要求1～3任一项所述的flipgfp探针在检测新冠病毒水解酶底物特异性中的应用。
5.新冠病毒靶点荧光探针，使用如权利要求1～3任一项所述的flipgfp探针制备，其特征在于，将编码3clpro的特异性底物的dna序列和/或编码plpro的...
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