【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白活性肽，特别涉及具有双向免疫功能的调节肽。
技术介绍
1、随着人们对健康的日益关注，调节免疫系统以增强自身免疫力越来越引起人们的关注。免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫因子构成，是机体抵御外界病原体入侵和感染的高度防御机制。左旋咪唑、环孢霉素和他克莫司等化学药物可以增强人体免疫反应，然而毒副作用和高成本限制了其广泛应用。这些化学药物在杀死入侵细菌的同时，还会造成细胞壁上的脂多糖释放和积聚，进而导致机体产生炎症。炎症通常与慢性疾病密切有关，例如ⅱ型糖尿病、炎症性肠病和高血压等。因此，开发一种能具有增强免疫力和抗炎活性，并且安全高效的产品来改善人体免疫机能具有重要的现实意义。
2、免疫活性肽作为小分子物质，具有无毒副作用、吸收效率高、稳定性好和功能活性强等优势，可以作为调节机体免疫的有效手段，具有巨大的应用前景。卵白蛋白是蛋清中含量最丰富的蛋白质，约占蛋清蛋白总量的54％，具有完整必需氨基酸组成，适合作为核心蛋白营养素用于健康食品研发。此外，卵白蛋白富含多种生物活性片段，是开发生物活性肽的优质蛋白质来源。据报道，卵白蛋白酶解物具有免疫增强、抗炎、抑菌和降血压等生理活性。然而，目前关于卵白蛋白源双向免疫调节肽还尚无研究，市面上高活性免疫调节的肽产品仍然很少。因此，通过合适手段提取卵白蛋白中的双向免疫调节肽不仅可以推动蛋品行业的深加工和高值化发展，同时拓宽了卵白蛋白肽的应用范围。
3、酶催化水解蛋白质和分离纯化是获得生物活性肽的传统方法。该方法耗时长、成本高、产率低，且多步分离纯化过程中容易造成
技术实现思路
1、本专利技术针对现有卵白蛋白肽的双向免疫调节能力探究不足，肽分离提取过程复杂，提供了一种卵白蛋白双向免疫调节肽及其制备方法和应用，首次通过生物信息学从卵白蛋白水解液中靶向筛选得到了一种目前尚未被报道的双向免疫调节肽，这种多肽具有3个不同的氨基酸序列，对巨噬细胞raw264.7均有显著的免疫增强和抗炎活性(即双向免疫调节功能)；可以作为免疫调节因子用于食品、保健品、医药和动物饲料中，具有良好的应用前景。
2、在第一方面，本专利技术提供了一种双向免疫调节肽，所述双向免疫调节肽的氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示。
3、seq id no.1的氨基酸序列具体为：
4、asn-val-met-glu-glu-arg-lys-ile-lys，缩写后即nvmeerkik。
5、seq id no.2的氨基酸序列具体为：
6、ala-asp-gln-ala-arg-glu-leu-ile-asn-ser，缩写后即adqarelins。
7、seq id no.3的氨基酸序列具体为：
8、trp-glu-lys-ala-phe-glu-asp-glu，缩写后即wekafkde。
9、通过试验进行进一步验证发现，这种多肽具有显著的免疫增强和抗炎活性；无细胞毒性，安全性好；能够广泛应用于(食品、药品、保健品、化妆品或动物饲料等)免疫抗炎制剂的生产研发。
10、进一步地，上述双向免疫调节肽来源于鸡蛋，主要为蛋清部分。
11、在第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，能够编码seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3中的至少1个所示的双向免疫调节肽的氨基酸序列。
12、在第三方面，本专利技术提供了一种重组载体，含有上述核酸分子。这种重组载体可以有效表达本专利技术提供的上述双向免疫调节肽。
13、在第四方面，本专利技术提供了一种重组细胞，含有上述核酸分子或重组载体。这种重组细胞可以在适宜的培养条件下，利用生物工程技术实现双向免疫调节肽的高效表达。
14、在第五方面，本专利技术提供了一种双向免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
15、在卵白蛋白水溶液中加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，灭酶、离心取上清液，干燥，得到本专利技术提供的上述双向免疫调节肽。
16、在进行双向免疫调节肽的制备时，申请人针对碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶和胃蛋白酶等多种酶，进行了各自单独使用或多种蛋白酶协同使用的试验，并最终意外地发现，当选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶时，就能够获得具有双向免疫调节功能的多肽；并且酶解产物的分子量<3kda，无需进一步分离纯化。
17、进一步地，上述制备方法中，所述卵白蛋白水溶液的质量分数为1-4％。
18、最优地，所述卵白蛋白水溶液的质量分数为2％。
19、进一步地，上述制备方法中，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为2-18u/mg，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:(1-8)。
20、更进一步地，上述制备方法中，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为10-15u/mg，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:(2-6)。
21、最优地，上述制备方法中，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为12u/mg，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:3。
22、需要说明的是，采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解时，可基于两种蛋白酶的最适温度和ph值范围进行综合调节，属于本领域的常用技术。
23、一般而言，酶解方式可选择在40-60℃，ph值＝5-10下酶解2-8h。
24、在第六方面，本专利技术提供了一种双向免疫调节肽的筛选方法，包括以下步骤：
25、在卵白蛋白水溶液中加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，灭酶、离心取上清液；将所述上清液采用lc-ms/ms法进行多肽序列分析，(例如，采用分子对接技术)筛选出若干个分子量＜1kda，长度在2-10个氨基酸，无毒并且具有潜在高活性的多肽，将若干所述多肽分别进行人工合成，测定所述多肽的免疫增强效果和抗炎活性，筛选获得目标双向免疫调节肽。
26、将若干所述多肽进行人工合成，通过体外细胞实验验证这些多肽的活性，获得本专利技术提供的上述双向免疫调节肽的3种氨基酸序列。
27、需要说明的是，上述筛选方法中，本专利技术采用的分子对接技术为行业内的常用技术。
28、一般地，分子对接技术为：从蛋白数据库中获取tlr4-md2的蛋白晶体结构(3fxi)，从3fxi中去除多余的配体和水；将多肽依次与3fxi对接后获得cdocker energy，tlr4-md2结合位点为包含的蛋白质残基的球体(x＝28.73，y＝-2.695，z＝14.63)；根据cdocker energy筛选结合能较低的多肽，所述结合能越低表示相应肽的免疫调节活性越强。
29、需要说明的是，根本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双向免疫调节肽，其特征在于，所述双向免疫调节肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的双向免疫调节肽的氨基酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸分子，或含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种双向免疫调节肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5或所述的双向免疫调节肽的制备方法，其特征在于，酶解的方法为：所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为2-18U/mg，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:(1-8)。
7.一种双向免疫调节肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.一种双向免疫抗炎制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的双向免疫调节肽。
9.一种不以疾病诊断和治疗为目的的提高双向免疫抗炎活性的方法，其特征在于，将权利要求1所述的双向免疫调节肽
10.权利要求1所述的双向免疫调节肽，或者权利要求5或6所述的制备方法制备的双向免疫调节肽，或者权利要求8所述的双向免疫抗炎制剂，在制备双向免疫抗炎产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种双向免疫调节肽，其特征在于，所述双向免疫调节肽的氨基酸序列如seq idno.1、seq id no.2或seq id no.3所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的双向免疫调节肽的氨基酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸分子，或含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种双向免疫调节肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5或所述的双向免疫调节肽的制备方法，其特征在于，酶解的方法为：所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为2-18u/m...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄茜，李祖悦，蔡朝霞，安东旭，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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