【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及用于治疗乙型肝炎病毒感染的核酸药物，更具体地，公开了用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的sirna，和含有sirna的药物组合物与sirna缀合物，还公开了涉及这些sirna、药物组合物与sirna缀合物的制备方法和用途。
技术介绍
1、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，是一种嗜肝性、含有双链dna的病毒。虽然dna是遗传物质，但是复制循环涉及将前基因组rna复制到dna中的逆转录步骤。乙型肝炎病毒被归类为嗜肝病毒中的一员，属于嗜肝病毒科。人乙型肝炎病毒的原发感染会引起急性肝炎，伴有器官炎症、发热、黄疸和血液中肝转氨酶升高的症状。那些无法克服病毒感染的患者遭受多年的慢性疾病发展，患肝硬化或肝癌的风险增加。hbv主要的传播途径是血液传播(输血和血制品)。其次是母婴传播，慢性乙型肝炎患者中，40％～50％的患者均来源于母婴传播。第三是密切接触传播，如通过精液和阴道分泌物传播病毒。第四是医源性传播，如消毒不彻底、不安全注射等。
2、hbv被肝细胞摄取后，核衣壳被转移到细胞核中并释放dna。在细胞核中，完成dna链合成并对缺口进行修复，得到3.2kb的共价、闭合、环状(covalently closed circular,ccc)超螺旋dna(简称ccc dna)。cccdna作为五种主要病毒mrna转录的模板，其长度分别为3.5、3.5、2.4、2.1和0.7kb。所有mrna都是5’-封端且3’端处多聚腺苷酸化。在所有五种mrna之间的
3、其中一个3.5kb长度的mrna作为核心蛋白和聚合酶产生的模板。此外，该同一转录物用作前基因组复制中间体并允许病毒聚合酶启动逆转录产生dna。核衣壳的形成需要核心蛋白。另一3.5kb长度的mrna编码前核心蛋白，即可分泌的乙肝e抗原(hbeag)。在不存在复制抑制剂的情况下，血液中的e抗原丰度与肝脏中的乙型肝炎病毒复制相关，并且用作监测疾病进展的重要诊断标志物。
4、2.4kb和2.1kb长度的mrna携带前s1、前s2和s的开放阅读框(open readingframe,orf)，用于表达病毒的大、中和小表面抗原。乙肝表面抗原(hepatitis b surfaceantigen，hbsag)与感染性完整颗粒相关联。此外，感染患者的血液还含有仅来源于乙肝表面抗原的非感染性颗粒，不含基因组dna或聚合酶。血液中可检测的乙肝表面抗原的完全和持久消耗被认为是乙型肝炎病毒清除的可靠指标。
5、0.7kb长度的mrna编码s蛋白。该基因产物对于病毒基因的有效转录很重要，并且还充当宿主基因表达的反式激活因子。后一种活性似乎对肝癌发展过程中的肝细胞转化很重要。
6、hbv治疗的主要目标是永久地抑制hbv复制并改善肝脏疾病。临床上重要的短期目标是实现hbeag-血清转化、血清谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的正常化、肝脏炎症的消退以及防止肝失代偿。治疗的最终目标是获得持久的反应以防止发生肝硬化和肝癌从而延长生存期。由于感染肝细胞的细胞核中特定形式的病毒共价闭合环状dna的持续存在，因此无法完全消除hbv感染。然而，由治疗引起的血清hbsag的清除是慢性hbv感染终止的标志，并且与最佳长期结果相关。
7、目前被批准上市的抗hbv药物主要是免疫调节剂(干扰素-α和聚乙二醇干扰素-α-2α)和抗病毒治疗药物(拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、克拉夫定等)。其中，抗病毒治疗药物属于核苷酸类药物，其作用机制是抑制hbv dna的合成，并不能直接减少hbsag水平。与延长治疗一样，核苷酸类药物显示hbsag清除速度类似于自然观察结果。
8、临床己有降低hbsag的疗法，但疗效不佳。因此，若能从基因水平沉默病毒的基因表达，阻断hbv的生成和复制，特别是hbsag和hbeag的产生，可从根本上降低病毒代谢和对肝细胞的侵染。小干扰rna(small interfering rna,sirna)可基于rna干扰(rnainterference,rnai)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断靶标目的基因的表达，从mrna翻译至蛋白这一层次发挥抑制作用，从而达到治疗疾病的目的。
9、因此，在尚无可在大部分患者中恢复对hbv的免疫控制的任何现行治疗方案的情况下，需要针对hbv感染的有效治疗，该治疗可在大多数患者中抑制病毒复制并恢复免疫控制。因此，在本领域中需要用于感染hbv或患有hbv相关疾病的受试者的替代疗法和联合疗法。
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、本专利技术提供的如下sirna及其修饰序列能够特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达，含有sirna的药物组合物或sirna缀合物能够特异性地靶向肝脏，从而可以抑制乙型肝炎病毒基因表达，实现乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症的治疗。
3、用于解决问题的方案
4、本专利技术第一方面提供了一种sirna，其中，所述sirna含有正义链和反义链，所述sirna中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列i，所述反义链含有一段核苷酸序列ii，所述核苷酸序列i和所述核苷酸序列ii至少部分地反相互补形成双链区，所述核苷酸序列i和所述核苷酸序列ii选自如下i)-iii)所示序列中的一组：
5、i)所述核苷酸序列i与seq id no:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异；
6、ii)所述核苷酸序列i与序列iii所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:3所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异；
7、iii)所述核苷酸序列i与序列v所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:4所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异；
8、在一些实施方案中，所述核苷酸序列i与seq id no:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列ii与seq id no:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；
9、或者，所述核苷酸序列i与序列iii所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列ii与seq id no:3所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；
10、或者，所述核苷酸序列i与序列v所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列ii与seq id no:4所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；
11、在一些优选的实施方案中，所述核苷酸序列i如seq id no:1所示；和/或所述核苷酸序列ii如seq id no:2所示；...
【技术保护点】
1.一种针对乙型肝炎病毒S蛋白的siRNA，其特征在于，所述siRNA为对于Genbank注册号为U95551.1的DNA的第258位至第278位核苷酸，和/或第684位至第704位核苷酸，和/或第688位至第708位核苷酸设计得到的；
2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；
3.如权利要求1或2所述的siRNA，其特征在于，所述正义链和/或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；
4.如权利要求3所述的siRNA，其特征在于，所述非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
5.如权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-
6.如权利要求4或5所述的siRNA，其特征在于，所述非氟代修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
7.如权利要求3-6中任一项所述的siRNA，其特征在于，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；
8.如权利要求7所述的siRNA，其特征在于，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合；
9.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，反义链的5’末端核苷酸为5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸类似物修饰的核苷酸；
10.如权利要求1-9中任一项所述siRNA，其选自下表中：
11.一种siRNA缀合物，其特征在于，所述siRNA缀合物含有权利要求1-10中任一项所述的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
12.如权利要求11所述的siRNA缀合物，其特征在于，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接；
13.如权利要求11或12所述的siRNA缀合物，其特征在于，所述siRNA缀合物具有如式(23)所示的结构：
14.如权利要求11所述的siRNA缀合物，其特征在于，所述缀合物具有式(24)、(25)或(26)所示的结构：
15.如权利要求14所述的siRNA缀合物，其特征在于，每个L1独立地选自于由基团A1-A14基团及任意组合所组成的组：
16.如权利要求14或15所述的siRNA缀合物，其特征在于，L1的长度为3-20个原子。
17.如权利要求15或16所述的siRNA缀合物，其中k1为2-10的整数，k2为2-10的整数，Rc为C1-C4烷基，Rd为A15、A16、A17、A18、A19的一种，Re为C1-C5烷基；
18.如权利要求11-17中任一项所述的siRNA缀合物，其特征在于，每个所述靶向基团独立地为与哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体亲和的配体；
19.如权利要求18所述的siRNA缀合物，其特征在于，至少一个或每个所述靶向基团为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。
20.如权利要求14-19中任一项所述的siRNA缀合物，其特征在于，R1上同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与R2中的P原子连接的连接位点；
21.如权利要求14-20所述的siRNA缀合物，其特征在于，所述R2中的P原子连接到所述siRNA正义链或反义链的末端；
22.一种细胞，其特征在于，包含权利要求1-10中任一项所述的siRNA，和/或权利要求11-21中任一项所述的siRNA缀合物。
23.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-10中任一项所述的siRNA，和/或权利要求11-21中任一项所述的siRNA缀合物，以及药用赋形剂。
24.权利要求1-10中任一项所述的siRNA，权利要求11～21中任一项所述的siRNA缀合物和/或权利要求22中所述的药物组合物在制...
【技术特征摘要】
1.一种针对乙型肝炎病毒s蛋白的sirna，其特征在于，所述sirna为对于genbank注册号为u95551.1的dna的第258位至第278位核苷酸，和/或第684位至第704位核苷酸，和/或第688位至第708位核苷酸设计得到的；
2.如权利要求1所述的sirna，其特征在于，所述核苷酸序列i与seq id no:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列ii与seq id no:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；
3.如权利要求1或2所述的sirna，其特征在于，所述正义链和/或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；
4.如权利要求3所述的sirna，其特征在于，所述非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
5.如权利要求4所述的sirna，其特征在于，所述核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷基修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-经取代的氨基修饰的核苷酸、2’-脱氧核苷酸中的一种；
6.如权利要求4或5所述的sirna，其特征在于，所述非氟代修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
7.如权利要求3-6中任一项所述的sirna，其特征在于，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；
8.如权利要求7所述的sirna，其特征在于，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合；
9.如权利要求1所述的sirna，其特征在于，反义链的5’末端核苷酸为5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸类似物修饰的核苷酸；
10.如权利要求1-9中任一项所述sirna，其选自下表中：
11.一种sirna缀合物，其特征在于，所述sirna缀合物含有权利要求1-10中任一项所述的sirna以及缀合连接至该sirna的缀合基团。
12.如权利要求11所述的sirna缀合物，其特征在于，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述sirna、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接；
13.如权利要求11或12所述的sirna缀合...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛凡，唐春雷，范为正，
申请(专利权)人：赛诺瑞生物医药技术无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：
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