一种siRNA及其缀合物制造技术

本发明专利技术提供了一种siRNA及其缀合物。本发明专利技术的siRNA及其缀合物以及含有它们的药物组合物具有良好的稳定性，较高的黄嘌呤氧化酶mRNA抑制活性，较低的脱靶效应，并且能够显著治疗尿酸代谢异常引发的疾病、特别是高尿酸血症以及痛风的疾病和/或病症。及痛风的疾病和/或病症。

【技术实现步骤摘要】
一种siRNA及其缀合物


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体而言，涉及一种用于抑制黄嘌呤氧化酶(XO)基因表达的siRNA及其缀合物，含有siRNA或其缀合物的药物组合物，这些siRNA及其缀合物、药物组合物的制备方法和用途。

技术介绍

[0002]痛风是一种与嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关的疾病。主要症状包括关节肿胀、疼痛，病程持续较长，可出现关节畸形。痛风的全球患病率为10％
‑
68％，发病率为0.58/1000～2.89/1000，痛风的全球发病率、患病率及病死率都有所上升，有研究预测痛风病死率在未来40年内将增加55％左右。
[0003]影响痛风发生发展的因素包括高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)、遗传与地理环境因素、年龄与性别、饮食饮酒、种族与民族，还有合并症及部分药物影响等，其中遗传因素最为关键。
[0004]痛风通常分为临床前期和痛风期，当体内嘌呤生成增多或尿酸排泄减少，血清尿酸水平大于6.8mg/dl，超过生理饱和阈值的水平，产生高尿酸血症。当HUA患者体内的尿酸形成与溶解的平衡被打破后，大量单钠尿酸盐(MSU)晶体沉积于关节滑液或血液中。当关节腔内的MSU被巨噬细胞识别后，启动核转录因子
‑
κB(NF
‑
κB)信号通路，进一步激活NOD样受体蛋白3(NOD
‑
likeretorprotein3,NLRP3)炎性体，随后释放白细胞介素
‑
1β(interleukin
‑
1β，IL
‑
1β)，招募中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)，促进炎症反应进而转归为慢性痛风性关节炎期。随着关节腔内晶体沉积的增多，关节软骨遭到破坏，引起骨侵蚀和骨破坏。若病变得不到有效控制，会出现不可逆性关节畸形和关节周围骨骼肌坏死，甚至导致残疾。
[0005]尿酸是内源性和膳食嘌呤代谢的最终代谢产物。黄嘌呤氧化酶(XO)和黄嘌呤脱氢酶(XDH)分别催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸，它们是同一酶的相互转化形式。这些酶是含钼卟啉的黄素蛋白，由大约145kDa的两个相同亚基组成。
[0006]黄嘌呤氧化酶(XO)是治疗痛风的关键靶点之一。通过抑制XO表达，能够有效的抑制次黄嘌呤、鸟嘌呤的产生，进而减少尿酸产生，从而达到缓解痛风疾病进程并逆转病情的目的。通过抑制XO基因的表达，能够在细胞水平上对尿酸代谢异常引发的疾病，特别是高尿酸血症以及痛风进行预防和治疗。
[0007]目前痛风的治疗分为急性发作的快速治疗和长期治疗，当痛风急性发作时，可以单独使用非体抗炎药、秋水仙碱或皮质类固醇，来控制MSU晶体引起的炎症反应，缓解急性炎症，病情严重时可联合用药。长期治疗通常是通过降低尿酸来治疗，最典型的是减少嘌呤分解抑制尿酸盐生成的药物(即黄嘌呤氧化酶抑制剂)：别嘌呤醇和非布索坦。
[0008]然而，对于痛风常见的共病患者，尤其是由于慢性肾脏疾病或肝脏损害导致的肾功能下降患者，禁用这些药物。由于疾病或病症的器官功能有限，或由于药物与用于治疗此类病症的药物的不良相互作用，它们的使用也可能局限于代谢综合征高血压、血脂异常、非
酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝(NAFLD)心血管疾病或糖尿病(I型或2型)患者。因此在许多含有并发症的患者，无法使用此类药物。
[0009]XO是由两个完全对称的结构单元共同组构成；每一个结构单元为145kDa，其催化中心是由一个钼蝶呤(Mo
‑
pt)中心、两个铁
‑
硫中心(Fe/S)和一个黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)共同组成。在对嘌呤类底物的催化化过程中，氧分子主要作为电子受体，过氧化氢是其还原产物，当底物与酶结合后，Mo(
Ⅵ
)被还原成Mo(Ⅳ)，电子经过黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、铁硫中心等一系列转移步骤传递给氧分子，并与氢离子形成过氧化氢，Mo(Ⅳ)则再次氧化成Mo(
Ⅵ
)。
[0010]黄嘌呤氧化酶(XO)在各种生物体中都有存在，尤其在牛乳中含量极高，其生物功能是可以在机体内催化嘌呤类物质产生尿酸，并伴随着自由基的生成，但是生物体尤其是人体中缺乏尿酸酶(一种分解尿酸的酶)，因此代谢的最终产物就是尿酸，当体内XO活性异常活跃时，则会导致大量尿酸的生成和过量积累，从而引发高尿酸血症的可能性，进而引起痛风的发作。所以高尿酸症治疗的目的是实现对XO基因和/或XO表达的持续抑制，从而达到尿酸含量的降低。
[0011]WO2021/257782A1披露了靶向黄嘌呤氧化酶(XO)的RNAi剂以及使用其抑制XO基因表达的方法和治疗患有XO相关疾病的受试者的方法。

技术实现思路

[0012]针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术旨在开发抑制XO基因表达和治疗尿酸代谢异常引发的疾病的siRNA药物，来抑制次黄嘌呤的产生，减少尿酸的生成，从而缓解痛风疾病的进程。
[0013]本专利技术提供的如下siRNA及其修饰序列能够特异性地抑制黄嘌呤氧化酶基因表达，本专利技术的siRNA、siRNA缀合物以及含有siRNA或siRNA缀合物的药物组合物能够特异性地靶向肝脏，从而可以抑制黄嘌呤氧化酶基因表达，实现尿酸代谢异常引发的疾病、特别是高尿酸血症以及痛风的预防和治疗。
[0014]一方面，本专利技术提供了一种siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反相互补形成双链区，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II选自如下(i)
‑
(ix)所示序列中的一组：
[0015](i)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：
[0016]5’‑
GGIGAGUAUUUCUCAGUAUTT
‑3’
(SEQ ID NO:1)
[0017]5’‑
AUGCUGAGAAAUACUCCCCTT
‑3’
(SEQ ID NO:2)
[0018](ii)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：
[0019]5’‑
CAGUGGCAUGAGAGUUUUATT
‑3’
(SEQ ID NO:3)
[0020]5’‑
UAAAACUCUCAUGCCACUGTT<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反相互补形成双链区，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II选自如下(i)
‑
(vi)所示序列中的一组：(i)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：5
’‑
GGIGAGUAUUUCUCAGUAUTT
‑3’
(SEQ ID NO:1)5
’‑
AUGCUGAGAAAUACUCCCCTT
‑3’
(SEQ ID NO:2)(ii)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：5
’‑
CAGUGGCAUGAGAGUUUUATT
‑3’
(SEQ ID NO:3)5
’‑
UAAAACUCUCAUGCCACUGTT
‑3’
(SEQ ID NO:4)(iii)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：5
’‑
GCAUGAGAGUUUUAUUCAATT
‑3’
(SEQ ID NO:5)5
’‑
UUGAAUAAAACUCUCAUGCTT
‑3’
(SEQ ID NO:6)(iv)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：5
’‑
GCGAAGGAUAAGGUUAUUUTT
‑3’
(SEQ ID NO:7)5
’‑
AAGUAACCUUAUCCUUCGCTT
‑3’
(SEQ ID NO:8)(v)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：5
’‑
CACCAUUGCUGUUCCAAAATT
‑3’
(SEQ ID NO:9)5
’‑
UUUUGGAACAGCAAUGGUGTT
‑3’
(SEQ ID NO:10)(vi)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：5
’‑
CAUGGACAACUGCUAUAAATT
‑3’
(SEQ ID NO:11)5
’‑
UUUAUAGCAGUUGUCCAUGTT
‑3’
(SEQ ID NO:12)。2.如权利要求1所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列之间任选具有不多于
1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异。3.如权利要求1或2所述的siRNA，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，优选地，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述siRNA，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。5.如权利要求4所述的siRNA，其中每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2
’
位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。6.如权利要求5所述的siRNA，其中，所述核苷酸的核糖基2
’
位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2
’‑
烷氧基修饰的核苷酸、2
’‑
经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2
’‑
烷基修饰的核苷酸、2
’‑
经取代的烷基修饰的核苷酸、2
’‑
氨基修饰的核苷酸、2
’‑
经取代的氨基修饰的核苷酸、2
’‑
脱氧核苷酸中的一种；所述核苷酸类似物选自异核苷酸、桥联的核苷酸或无环核苷酸；特别地，异核苷酸是碱基从核糖环的1
’‑
位移动至2
’‑
位或3
’‑
位而形成的化合物；桥联的核苷酸为选自式(6)所示的LNA、式(7)所示的ENA、式(8)所示的cET中的一种，无环核苷酸为选自式(9)所示的UNA和式(10)所示的GNA中的一种，其中，上述式(6)至式(10)中，Base表示核酸碱基，R
a
选自H、OH或C1‑
C
10
烷氧基(O
‑
烷基)。7.如权利要求4
‑
6中任一项所述的siRNA，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，优选地，所述甲氧基修饰的核苷酸为核糖基的2
’‑
羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。8.如权利要求3所述的siRNA，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基的磷酸
二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。9.如权利要求3或8所述的siRNA，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(13)所示结构的硫代磷酸酯基：10.如权利要求8或9所述siRNA，其中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合；或者，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5
’
末端以外的全部上述位置处，或者，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3
’
末端以外的全部上述位置处。11.如权利要求1所述siRNA，其中，反义链的5
’
末端核苷酸为5
’‑
磷酸核苷酸或5
’‑
磷酸类似物修饰的核苷酸；特别地，5
’‑
磷酸核苷酸为式(14)所示的含有5
’‑
磷酸修饰的核苷酸，5
’‑
磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，如式(15)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(17)所示，其中，R选自Η、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。12.如权利要求1
‑
11中任一项所述siRNA，其选自下表中：
13.一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有权利要求1
‑
12中任一项所述的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。14.如权利要求13所述的siRNA缀合物，其中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接。15.如权利要求14所述的siRNA缀合物，其中，所述接头具有如式(19)所示的结构：其中，m为1
‑
3的整数；L
A
是具有如式(20)所示结构的包含酰胺键的链状部分，每个所述L
A
在其两端分别与一个所述靶向基团和所述L
C
部分通过醚键相连接：L
B
是具有如式(21)所示结构的包含N
‑
酰基吡咯烷的链状部分，所述链状部分在其一端具有羰基并与所述L
C
部分通过酰胺键相连接，在另一端具有氧原子并与所述siRNA通过磷酸酯键相连接：
L
C
是基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的2
‑
4价连接基团，所述L
C
经由氧原子与各个所述L
A
部分通过醚键相连接，并且经由氮原子与所述L
B
部分通过酰胺键相连接。16.如权利要求13
‑
15中任一项所述的siRNA缀合物，其中，所述连接头连接至所述siRNA的正义链3
’
末端或正义链5
’
末端。17.如权利要求13所述的siRNA缀合物，其中，所述缀合物具有式(24)、(25)或(26)所示的结构：其中，R2为式(S1)所示结构的基团：其中，E1为OH或SH,Nu为权利要求1
‑
12中任一项所述的siRNA；R1是长度为1
‑
20个碳原子的直链亚烷基或环状亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2‑
C
10
亚烯基、C2‑
C
10
亚炔基、C6‑
C
10
亚芳基、C3‑
C
18
亚杂环基和C5‑
C
10
亚杂芳基；并且其中R1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1‑
C
10
烷基、C6‑
C
10
芳基、C5‑
C
10
杂芳基、C1‑
C
10
卤代烷基、
‑
OC1‑
C
10
烷基、
‑
OC1‑
C
10
烷基苯基、
‑
C1‑
C
10
烷基
‑
OH、
‑
OC1‑
C
10
卤代烷基、
‑
SC1‑
C
10
烷基、
‑
SC1‑
C
10
烷基苯基、
‑
C1‑
C
10
烷基
‑
SH、
‑
SC1‑
C
10
卤代烷基、卤素取代基、
‑
OH、
‑
SH、
‑
NH2、
‑
C1‑
C
10
烷基
‑
NH2、
‑
N(C1‑
C
10
烷基)(C1‑
C
10
烷基)、
‑
NH(C1‑
C
10
烷基)、
‑
N(C1‑
C
10
烷基)(C1‑
C
10
烷基苯基)、
‑
NH(C1‑
C
10
烷基苯基)、氰基、
‑
CO2H、C(O)O(C1‑
C
10
烷基)、
‑
CON(C1‑
C
10
烷基)(C1‑
C
10
烷基)、
‑
CONH(C1‑
C
10
烷基)、
‑
CONH2、
‑
NHC(O)(C1‑
C
10
烷基)、
‑
NHC(...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐春雷，范为正，袁昕，姜虹羽，
申请(专利权)人：赛诺瑞生物医药技术无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：