【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物活性成分的提取与制备，尤其是涉及烯还原酶突变体及其应用。
技术介绍
1、化合物i是来源于胡椒的一种活性成分，其具有促进细胞膜流动、抗惊厥、镇痛等作用。化合物i通过增加脂质双层的流动性和增加药物分子或营养物质与细胞膜的亲和力，从而促进皮肤组织对一些有效活性成分的吸收利用，是一种安全的促渗剂。然而，其在胡椒中的产量较低，提取难度大。
2、目前化合物i的制备主要依靠化学法对化合物ii进行加氢获得，但化学法主要以过渡金属为催化剂实现α,β-不饱和羰基的碳碳双键的选择性加氢反应，存在成本高、反应收率和选择性不理想、需要以存在安全隐患的氢气作为氢源、反应条件苛刻及环境污染等问题。
3、其中化合物i和化合物ii的分子式如下所示：
4、
5、现有技术中已经报道了多种可以专一性还原α,β-不饱和羰基的碳碳双键的烯还原酶，该类酶可以利用nad(p)h作为辅因子提供还原力。如中链脱氢酶/还原酶(medium-chain dehydrogenases/reductases)和老黄酶(old yellow enzyme)。然而，目前对可以还原化合物ii的烯还原酶报道较少，需要开发更多的烯还原酶用于化合物ii的生物合成。。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了烯还原酶突变体及其应用。该突变体可以高效催化化合物ii还原生成化合物i，本专利技术还提供了化合物i的生物合成方法，具有良好的工业化应用前景。
2、本专
3、烯还原酶突变体，所述突变体是通过对氨基酸序列为seq id no.1所示的野生型烯还原酶的g77、y99和a285中至少一个位点进行定点突变得到的。
4、优选的，所述突变为g77i、y99l和a285f。
5、进一步地，所述突变体的编码基因为如seq id no.2所示的dna序列。
6、本专利技术还提供了所述的烯还原酶突变体的应用，即所述烯还原酶突变体可以催化化合物ii生成化合物i；其中化合物i和化合物ii的分子式如下所示：
7、
8、
9、进一步地，所述催化过程包含以下步骤：
10、s1、构建表达所述烯还原酶突变体的重组工程菌；
11、s2、含烯还原酶突变体的重组工程菌的培养；
12、s3、以化合物ii为底物，利用烯还原酶突变体催化化合物ii得到化合物i。
13、优选的，步骤s3所述的烯还原酶突变体的加入形式包括纯化后的酶、含烯还原酶突变体的粗酶液、或者表达烯还原酶突变体的重组工程菌。
14、优选的，步骤s3所述的催化反应中，烯还原酶突变体的用量为5-50g/l湿菌体，化合物ii用量为1-40g/l，吐温80用量为1-35g/l，葡萄糖用量为5-30g/l。
15、优选的，步骤s3所述的催化反应以磷酸盐缓冲液为体系溶液，ph为6.0-8.0，反应温度为25-40℃，反应时间为1-72h。
16、优选地，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)。
17、本专利技术有益的技术效果在于：
18、本专利技术公开了一种烯还原酶的突变体及应用，该突变体可以催化化合物ii生成化合物i，产物纯度大于99％。解决了化学催化成本高、收率低的问题，为化合物i的工业化生产奠定基础。
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1.烯还原酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过对氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的野生型烯还原酶的G77、Y99和A285中至少一个位点进行定点突变得到的。
2.根据权利要求1所述的烯还原酶突变体，其特征在于，所述突变为G77I、Y99L和A285F。
3.根据权利要求1或2所述的烯还原酶突变体，其特征在于，所述突变体的编码基因为如SEQ ID No.2所示的DNA序列。
4.权利要求1所述的烯还原酶突变体的应用，其特征在于，所述烯还原酶突变体用于催化化合物II生成化合物I；其中化合物I和化合物II的分子式如下所示：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述催化过程包含以下步骤：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤S3所述的烯还原酶突变体的加入形式包括纯化后的酶、含烯还原酶突变体的粗酶液、或者表达烯还原酶突变体的重组工程菌。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤S3所述的催化反应中，烯还原酶突变体的用量为5-50g/L湿菌体，化合物II用量为1-40g/L，吐温80 用量为
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤S3所述的催化反应以磷酸盐缓冲液为体系溶液，pH为6.0-8.0，反应温度为25-40℃，反应时间为1-72h。
...【技术特征摘要】
1.烯还原酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过对氨基酸序列为seq id no.1所示的野生型烯还原酶的g77、y99和a285中至少一个位点进行定点突变得到的。
2.根据权利要求1所述的烯还原酶突变体，其特征在于，所述突变为g77i、y99l和a285f。
3.根据权利要求1或2所述的烯还原酶突变体，其特征在于，所述突变体的编码基因为如seq id no.2所示的dna序列。
4.权利要求1所述的烯还原酶突变体的应用，其特征在于，所述烯还原酶突变体用于催化化合物ii生成化合物i；其中化合物i和化合物ii的分子式如下所示：
5.根据权利要求4所述的应...
【专利技术属性】
技术研发人员：王金城，焦松，陈秋慧，李禾钱，
申请(专利权)人：杭州佳嘉乐生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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