【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于球虫耐药性检测，具体地说，涉及一种与艾美耳球虫盐霉素耐药性相关的snp分子标记及其应用。
技术介绍
1、鸡球虫病是一种由艾美耳属球虫引起的寄生于肠道的寄生虫病，能够引起鸡食欲不振、生产性能下降甚至诱发死亡等临床症状，造成养殖业重大的经济损失。目前已发现并公认能够引起感染的艾美耳球虫有7种，即柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫以及布氏艾美耳球虫。现有针对球虫病的防控多以药物预防为主，疫苗使用为辅。
2、迄今为止，抗球虫药主要分为两大类，一类是聚醚离子载体类药物，包括盐霉素、莫能菌素、马杜霉素等；另一类是化学合成类药物，包括常山酮、地克珠利、磺胺等药物。抗球虫药的使用能够在很大程度上降低规模化养殖业的损失，但是随着药物的广泛使用，各地区耐药株相继报道。耐药性的出现不仅严重阻碍病毒病和细菌病的有效防控，同样也是寄生虫领域面临的亟待解决的重要问题。耐药株的出现极大降低药物的防控效率，新型抗球虫药的研发势在必得。新型抗球虫药物研发需要了解旧药作用机理以及耐药产生机制，但较为遗憾的是，迄今球虫领域与耐药表型相关的基因及机制等仍鲜有公开报道，这也反映出该领域的研究仍存在挑战。
3、盐霉素(salinomycin)作为聚醚离子载体类药物，因其具备广泛抗球虫等优势，多应用于球虫病的防控。该药物能够对球虫早期子孢子、第一代裂殖体发育有明显的抑制作用。然而该药物于1983年投入市场，1984年就已在美国分离到盐霉素耐药株，而我国则在1996年在田间检测到
4、由于目前球虫领域耐药性检测还多以笼饲实验为主，这一方法虽然结果真实可靠，但是其过程相对复杂(需要大量新鲜孢子化卵囊、实验动物等)，且实验周期较长，此外还存在多重耐药性的干扰。所以，亟待开发一款快速检测鸡球虫盐霉素耐药性的试剂盒，以便对田间耐药表型进行快速筛选，降低养殖业损失。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种与艾美耳球虫盐霉素耐药性相关的snp分子标记及其应用。
2、为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种与艾美耳球虫盐霉素耐药性相关的snp分子标记，所述snp分子标记含有如seq id no:1所示序列的第711位的多态性为t/c的(n为t或c)核苷酸序列；
3、该位点的碱基为c，对应于盐霉素耐药虫株(盐霉素耐药表型)，该位点的碱基为t，对应于盐霉素敏感虫株(盐霉素敏感表型)。
4、第二方面，本专利技术提供用于扩增所述snp分子标记的引物对，包括：
5、对于柔嫩艾美耳球虫，用于扩增所述snp分子标记的引物对tn，其包括(seq idno:2-3)：
6、tn-f：5′-atgtcagcagcagctcaaag-3′；
7、tn-r：5′-gcagcagcctggcgacatcg-3′；
8、对于堆型艾美耳球虫，用于扩增所述snp分子标记的引物对ac，其包括(seq idno:4-5)：
9、ac-f：5′-atgtcaggtgtatatagccc-3′；
10、ac-r：5′-gggtttagggtttctgaatt-3′；
11、对于毒害艾美耳球虫，用于扩增所述snp分子标记的引物对ne，其包括(seq idno:6-7)：
12、ne-f：5′-atggcagcagcaactcaaag-3′；
13、ne-r：5′-ccaggcggacatttcctcgg-3′；
14、对于巨型艾美耳球虫，用于扩增所述snp分子标记的引物对mx，其包括(seq idno:8-9)：
15、mx-f：5′-atgcttctccgcctcgtaga-3′；
16、mx-r：5′-gacaaccacatgcagcccca-3′；
17、对于和缓艾美耳球虫，用于扩增所述snp分子标记的引物对mt，其包括(seq idno:10-11)：
18、mt-f：5′-atgtccggtgtatcgccagc-3′；
19、mt-r：5′-tatcagtaacagatagagga-3′；
20、对于早熟艾美耳球虫，用于扩增所述snp分子标记的引物对pr，其包括(seq idno:12-13)：
21、pr-f：5′-atgggccctcctagacagtc-3′；
22、pr-r：5′-acctgcagcccccatggcgag-3′；
23、对于布氏艾美耳球虫，用于扩增所述snp分子标记的引物对br，其包括(seq idno:14-15)：
24、br-f：5′-atgcacctccccgccctcat-3′；
25、br-r：5′-atgccccctcgaccatcctg-3′。
26、第三方面，本专利技术提供含有所述引物对的试剂或试剂盒。
27、第四方面，本专利技术提供所述snp分子标记、所述引物对或含有所述引物对的试剂或试剂盒在鉴定艾美耳球虫盐霉素耐药性中的应用。
28、第五方面，本专利技术提供一种鉴定艾美耳球虫盐霉素耐药性的方法，以待测艾美耳球虫的cdna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增；分析pcr扩增产物中所述snp分子标记的单核苷酸多态性，根据多态性位点判断待测艾美耳球虫为耐药或敏感表型。
29、进一步地，所述pcr扩增的反应程序为：95℃3-5min；95℃30s，55℃30s，72℃10-20s(10s/kb)，30-40个循环；72℃5-10min。优选所述pcr扩增的反应程序为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min。
30、进一步地，判断待测艾美耳球虫为耐药或敏感表型的方法如下：
31、若所述snp分子标记具有所述多态性位点的碱基为c，则待测艾美耳球虫为盐霉素耐药表型，若所述snp分子标记具有所述多态性位点的碱基为t，则待测艾美耳球虫为盐霉素敏感表型。
32、借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
33、本专利技术提供一种球虫耐药性检测方法，所述方法利用不同种特异性引物对对所述鸡球虫基因组进行特异性扩增，后续通过对pcr扩增产物进行检测，筛查snp位点即可确定鸡球虫是否具备盐霉素耐药表型。该方案的优势在于不需要大量新鲜的球虫卵囊、实验动物及场地，与传统笼饲实验相比，具备耗时短、特异性强、操作简单以及成本低等优势，可以推广至鸡球虫其它耐药性临床检测。
34、本专利技术中涉及的耐药性检测试剂盒里包含鸡球虫7种不同种的特异性引物，能够实现盐霉素耐药及敏感株分子水平的检测。该方法相较于传统笼饲实验具有检测耗时短、操作简单、检测成本低等优势，可广泛应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.与艾美耳球虫盐霉素耐药性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记含有如SEQ ID NO:1所示序列的第711位的多态性为T/C的核苷酸序列；
2.用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物对，其特征在于，包括：
3.含有权利要求2所述引物对的试剂或试剂盒。
4.权利要求1所述SNP分子标记、权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂或试剂盒在鉴定艾美耳球虫盐霉素耐药性中的应用。
5.一种鉴定艾美耳球虫盐霉素耐药性的方法，其特征在于，以待测艾美耳球虫的cDNA为模板，利用权利要求2所述引物对进行PCR扩增；分析PCR扩增产物中权利要求1所述SNP分子标记的单核苷酸多态性，根据多态性位点判断待测艾美耳球虫为耐药或敏感表型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃3-5min；95℃30s，55℃30s，72℃10-20s，30-40个循环；72℃5-10min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃3min；95℃30s
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，判断待测艾美耳球虫为耐药或敏感表型的方法如下：
...【技术特征摘要】
1.与艾美耳球虫盐霉素耐药性相关的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记含有如seq id no:1所示序列的第711位的多态性为t/c的核苷酸序列；
2.用于扩增权利要求1所述snp分子标记的引物对，其特征在于，包括：
3.含有权利要求2所述引物对的试剂或试剂盒。
4.权利要求1所述snp分子标记、权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂或试剂盒在鉴定艾美耳球虫盐霉素耐药性中的应用。
5.一种鉴定艾美耳球虫盐霉素耐药性的方法，其特征在于，以待测艾美耳球虫的cdna为模板，利用权利要求2所述引物对进行pcr扩增；分析pc...
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