【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽纯化的，特别涉及一种多肽生产纯化工艺及验证方法。
技术介绍
1、多肽是一类由氨基酸残基通过肽键连接形成的生物大分子，因其多样的生物活性和治疗潜力，在药物开发、生物技术以及食品工业等领域占有重要地位，在多肽的生产过程中，蛋白提取、酶解水解和纯化步骤是获得目标多肽的关键环节。
2、而在多肽纯化方面，使用的单一纯化方法缺少对于操作参数精细化控制的方法，未能充分利用数据分析和模型构建的方法来优化大孔树脂纯化工艺，导致纯化过程效率不高，多肽纯度和收率难以达到最佳状态，且验证步骤没有全面覆盖多肽在实际应用中可能遇到的各种条件，对酸碱度、温度以及消化酶等方面的稳定性评估并不充分，这限制了多肽产品应用的范围和生物活性的发挥。
3、因此，本专利技术提供了一种多肽生产纯化工艺及验证方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种多肽生产纯化工艺及验证方法，通过对制备多肽的蛋白提取工艺参数进行优化，获取科学的参数，能够提高蛋白提取的纯度和产量，降低制造成本，再通过分析大孔吸附树脂参数对多肽纯化度的影响，所采用的曲线拟合法对参数进行进一步优化，有助于纯化步骤的精细化操作，建立多肽纯度优化模型，能够精确大孔吸附树脂参数，提高多肽纯化后的纯度，随后将酸碱度、温度以及消化酶的影响纳入验证范围，能够确保制备出的多肽在不同的条件下具有保证多肽结构和功能的稳定性，降低实验人员人为主观判断工艺参数导致多肽纯化度低的概率。
2、为了达成以上目的，本专利技术采取的
3、一种多肽生产纯化工艺及验证方法，包括以下具体步骤：
4、步骤一，用于制备多肽的蛋白提取工艺参数优化；
5、步骤二，双酶法水解蛋白制备多肽；
6、步骤三，多肽的分离和纯化；
7、步骤四，对获取的多肽进行稳定性验证。
8、进一步的，在步骤一中，用于制备多肽的蛋白提取工艺优化，所用优化参数选取分别为制备多肽的蛋白提取液中的料液比，提取液的ph值，提取的时间，提取的温度，所用制备多肽的蛋白分子量，所用制备多肽的原料纯度和所用制备多肽的蛋白氨基酸种类比。
9、作为本专利技术的进一步方案，在步骤一中，用于制备多肽的蛋白提取工艺优化，使用主成分分析法，以蛋白提取出的纯度为响应因素，进行参数的优化，其中以主要成分影响因子占总体影响值的95-100％之间为界限，进行主成分的分析，所得影响制备多肽的蛋白提取纯度工艺的主成分分别为蛋白提取液中的料液比，提取液的ph值，提取的时间和提取的温度，其中蛋白提取液中的料液比为0.2-1，提取液的ph值范围为5-11，提取的时间为1-4h，提取的温度为20-60℃。
10、作为本专利技术的进一步方案，在步骤一中，依据获取的主成分种类，以蛋白提取液中的料液比，提取液的ph值，提取的时间和提取的温度使用为四个因素，与提取蛋白的纯度进行优化分析，所用优化方法为响应面法，在进行响应面法优化前，分别对四个因素进行单因素分析，以显著性<0.05为界限，再次进行验证，并获取蛋白提取液中的料液比，提取液的ph值，提取的时间和提取的温度四个因素的相关影响因子，并将影响因子导入响应面优化程序中，所用蛋白提取工艺参数的优化方程为：
11、
12、其中，cd为提取用于制备多肽的蛋白纯度，β0为基于优化所用蛋白提取工艺参数进行响应面分析中的相关常数，β1-β5为基于优化所用蛋白提取工艺参数进行响应面分析中的相关系数，a为用于制备多肽的蛋白提取液中的料液比，b为用于制备多肽的蛋白提取液中的ph值，c为用于制备多肽的蛋白提取时间，d为用于制备多肽的蛋白提取温度，α1为用于制备多肽的蛋白提取液中的料液比单因素分析的相关系数，α2为用于制备多肽的蛋白提取液中的ph值单因素分析的相关系数，α3为用于制备多肽的蛋白提取时间单因素分析的相关系数，α4为为用于制备多肽的蛋白提取温度单因素分析的相关系数。
13、进一步的，在步骤二中，所用双酶法水解蛋白制备多肽所用的酶为碱性蛋白酶和复合蛋白酶，其中碱性蛋白酶和复合蛋白酶添加的重量份数百分比，碱性蛋白酶为20-60％，复合蛋白酶为40-80％。
14、作为本专利技术的进一步方案，在步骤二中，对碱性蛋白酶和复合蛋白酶添加的重量份数百分比范围进行精确，通过分别对碱性蛋白酶和复合蛋白酶进行曲线的拟合获取精确范围，其中，碱性蛋白酶为30-33％，复合蛋白酶为67-70％。
15、进一步的，在步骤三中，对多肽进行分离和纯化，所用分离纯化工艺方法为大孔吸附树脂法，为了进一步提升大孔吸附树脂对吸附多肽的效率和提高多肽纯化度，对大孔吸附树脂的相关工艺参数变化的数据和多肽纯化度进行收集汇总，所收集大孔吸附树脂的相关参数数据分别为进行大孔吸附树脂实验时的上样样品的ph值，上样样品的流速和洗脱剂的浓度及流速，其中所用洗脱剂为乙醇。
16、作为本专利技术的进一步方案，在步骤三中，所用进行大孔吸附树脂实验时的上样样品的ph值为3-7，上样样品的流速为1-4bv/h，洗脱剂乙醇的浓度为60-80％及洗脱剂的流速为2-3bv/h。
17、作为本专利技术的进一步方案，在步骤三中，分别对进行大孔吸附树脂实验时的上样样品的ph值，上样样品的流速和洗脱剂的浓度及洗脱剂流速，其中所用洗脱剂为乙醇进行单因素分析，使用曲线拟合法，对大孔吸附树脂的参数进行数据处理，大孔吸附树脂实验中的上样样品的ph值进行指数曲线拟合，对上样样品的流速和洗脱剂的流速进行对数曲线拟合，其中，在对洗脱剂乙醇浓度进行曲线拟合前进行归一化处理，限定浓度范围在0-1之间，随后进行单因素分析的曲线拟合，将曲线拟合处理后的上样样品的ph值，上样样品的流速和洗脱剂的浓度及洗脱剂流速再次与多肽的纯化度进行多因素相关性分析，构建多肽纯化模型，所用多肽纯化模型的公式为：
18、
19、其中，y为多肽的纯化度，x1为进行大孔吸附树脂实验时的上样样品的ph值，x2为进行大孔吸附树脂实验时的上样样品的流速，x3为进行大孔吸附树脂实验时的洗脱剂的浓度，x4为进行大孔吸附树脂实验时的洗脱剂的流速，γ0为常数，γ1-γ3为基于多因素分析所得多肽纯化模型的相关系数。
20、作为本专利技术的进一步方案，在步骤三中，基于大孔吸附树脂实验的纯化后，再次进行凝胶的层析和反向高效液相色谱纯化。
21、进一步的，在步骤四中，所用验证方法为酸碱承受度稳定性验证、温度稳定性验证以及消化酶耐受性验证，其中所用酸碱承受度稳定性检测ph指标为2-12，所用温度稳定性验证温度检测指标为零下80-20℃和水浴条件下40-100℃，所用消化酶消化时间检测指标为0-2h。
22、本专利技术的一种多肽生产纯化工艺及验证方法具有的有益效果：通过对制备多肽的蛋白提取工艺参数进行优化，获取科学的参数，能够提高蛋白提取的纯度和产量，降低制造成本，再通过分析大孔吸附树脂参数对多肽纯化度的影响，所采用的曲线拟合法对参数进行进一步优化，有本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽生产纯化工艺及验证方法，包括以下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤一中，用于制备多肽的蛋白提取工艺优化，所用优化参数选取分别为制备多肽的蛋白提取液中的料液比，提取液的PH值，提取的时间，提取的温度，所用制备多肽的蛋白分子量，所用制备多肽的原料纯度和所用制备多肽的蛋白氨基酸种类比。
3.根据权利要求2所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤一中，用于制备多肽的蛋白提取工艺优化，使用主成分分析法，以蛋白提取出的纯度为响应因素，进行参数的优化，其中以主要成分影响因子占总体影响值的95-100％之间为界限，进行主成分的分析，所得影响制备多肽的蛋白提取纯度工艺的主成分分别为蛋白提取液中的料液比，提取液的PH值，提取的时间和提取的温度，其中蛋白提取液中的料液比为0.2-1，提取液的PH值范围为5-11，提取的时间为1-4h，提取的温度为20-60℃。
4.根据权利要求2所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤一中，依据获取的主成分种类，以蛋白提取液中的料液比，提
5.根据权利要求1所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤二中，所用双酶法水解蛋白制备多肽所用的酶为碱性蛋白酶和复合蛋白酶，其中碱性蛋白酶和复合蛋白酶添加的重量份数百分比，碱性蛋白酶为20-60％，复合蛋白酶为40-80％。
6.根据权利要求5所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤二中，对碱性蛋白酶和复合蛋白酶添加的重量份数百分比范围进行精确，通过分别对碱性蛋白酶和复合蛋白酶进行曲线的拟合获取精确范围，其中，碱性蛋白酶为30-33％，复合蛋白酶为67-70％。
7.根据权利要求1所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤三中，对多肽进行分离和纯化，所用分离纯化工艺方法为大孔吸附树脂法，为了进一步提升大孔吸附树脂对吸附多肽的效率和提高多肽纯化度，对大孔吸附树脂的相关工艺参数变化的数据和多肽纯化度进行收集汇总，所收集大孔吸附树脂的相关参数数据分别为进行大孔吸附树脂实验时的上样样品的PH值，上样样品的流速和洗脱剂的浓度及流速，其中所用洗脱剂为乙醇。
8.根据权利要求7所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤三中，所用进行大孔吸附树脂实验时的上样样品的PH值为3-7，上样样品的流速为1-4BV/h，洗脱剂乙醇的浓度为60-80％及洗脱剂的流速为2-3BV/h。
9.根据权利要求7所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤三中，基于大孔吸附树脂实验的纯化后，再次进行凝胶的层析和反向高效液相色谱纯化。
...【技术特征摘要】
1.一种多肽生产纯化工艺及验证方法，包括以下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤一中，用于制备多肽的蛋白提取工艺优化，所用优化参数选取分别为制备多肽的蛋白提取液中的料液比，提取液的ph值，提取的时间，提取的温度，所用制备多肽的蛋白分子量，所用制备多肽的原料纯度和所用制备多肽的蛋白氨基酸种类比。
3.根据权利要求2所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤一中，用于制备多肽的蛋白提取工艺优化，使用主成分分析法，以蛋白提取出的纯度为响应因素，进行参数的优化，其中以主要成分影响因子占总体影响值的95-100％之间为界限，进行主成分的分析，所得影响制备多肽的蛋白提取纯度工艺的主成分分别为蛋白提取液中的料液比，提取液的ph值，提取的时间和提取的温度，其中蛋白提取液中的料液比为0.2-1，提取液的ph值范围为5-11，提取的时间为1-4h，提取的温度为20-60℃。
4.根据权利要求2所述的一种多肽生产纯化工艺及验证方法，其特征在于，在步骤一中，依据获取的主成分种类，以蛋白提取液中的料液比，提取液的ph值，提取的时间和提取的温度使用为四个因素，与提取蛋白的纯度进行优化分析，所用优化方法为响应面法，在进行响应面法优化前，分别对四个因素进行单因素分析，以显著性<0.05为界限，再次进行验证，并获取蛋白提取液中的料液比，提取液的ph值，提取的时间和提取的温度四个因素的相关影响因子，并将影响因子导入响应面优化程序中，所用蛋白提取工艺参数的优化方程...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯丽强，雷文益，许杨阳，姜力华，吕金波，
申请(专利权)人：杭州诺泰诺和生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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