【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及固定化酶领域，具体涉及一种固定化转氨酶的制备方法及其应用。
技术介绍
1、手性胺是各种药物的关键中间体，大约40％的手性药物含有手性胺官能团。(r)-(+)-1-(1-萘基)乙胺((r)-nea)是用于合成治疗继发性甲状腺功能亢进和高钙血症药物—盐酸西那卡塞的重要手性胺成分。转氨酶合成(r)-nea因其反应条件温和、原子经济性高、具有优异的化学选择性等而受到研究人员的青睐。转氨酶是5’-磷酸吡哆醛(plp)依赖性酶，能够催化前手性酮生成手性胺，具有严格的立体选择性和100％的理论产率。ω-转氨酶(ω-atas)属于iv型超家族转氨酶类，尽管各种ω-atas在手性胺的合成中表现出潜在的性能，但它们的大规模生产应用仍然存在稳定性不足和可回收性差的问题。在ω-atas的催化应用中，经常加入有机溶剂来助溶非天然有机底物。然而，有机溶剂的使用很容易导致ω-atas失活，这将在一定程度上增加酶的成本。此外，如果酶和其他细胞杂质不能有效地从反应体系中分离出来，也会导致产品提取过程中出现严重的乳化现象，增加了产品分离、纯化的难度，降低了产品纯度。
2、随着材料科学的快速发展，固定化作为一种新兴的分子修饰方法引起了研究人员的关注。与游离酶相比，固定化酶在工业应用中具有良好的优势，如操作稳定性高，固定化酶的可回收性，加速后期分离和纯化。特别是对于有机溶剂存在的酶促反应，通过固定化提高酶对有机溶剂的耐受性尤为重要。公开号为cn115806967a的专利技术专利公开了一种以树脂经多聚羟基化合物或多聚氨基化合物修饰后醛基化所得为
3、多壁碳纳米管(mwcnts)是一种新型的固定化纳米材料，由多层石墨片沿着中心轴以一定的角度旋转而形成的，具有吸附能力强、比表面积大、稳定性好、生物相容性良好、表面官能团可控等特性。mwcnts可以保护酶免受恶劣条件的影响，同时由于其较高的化学和结构稳定性，允许小分子底物/产物的传递。以mwcnts为载体的共价结合是主要的固定化方法，它利用mwcnts表面的可控官能团与蛋白质表面的氨基酸残基，如氨基、羧基、羟基等形成共价键。公开号为cn104404027a的专利技术专利公开了一种通过等离子体处理多壁碳纳米管为载体固定化酶的方法，与未经处理的多壁碳纳米管相比，提高了酶活和酶蛋白负载量。
4、上述专利通过不同的方法对固定化载体进行修饰后用于酶的固定化，可提高酶活或酶蛋白负载量，但还是存在固定化步骤繁琐的问题，而且对于酶的固定条件和有机溶剂耐受性的研究较少，因此，迫切需要开发一种提高ω-atas有机溶剂耐受性和可重复使用性的策略。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种固定化转氨酶的制备方法，以氨基化修饰的多壁碳纳米管(mwcnts-nh2)为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶(atata@mwcnts-nh2)，并优化确定了ω-转氨酶的最佳固定化条件。通过ω-转氨酶的有机溶剂耐受性研究，构建催化反应的非水相体系，催化1-乙酰基萘反应生成(r)-nea。
2、本专利技术提供的一种固定化转氨酶的制备方法，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，其中，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应40～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为1～10％；固定化时ph为5～9，温度为4～64℃，时间为5～300min。
3、优选的，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应120～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为2.5～5％；固定化时ph为6～8，温度为15～37℃，时间为5～30min。
4、更优选的，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应160mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为3.3％；固定化时ph为8，温度为25℃，时间为10min。
5、在上述最佳固定条件下，固定化转氨酶在催化过程中的酶活性回收率最高。
6、优选的，固定化转氨酶的制备方法包括以下步骤：
7、(1)氨基化多壁碳纳米管与盐酸混合搅拌，离心用去离子水洗涤，通过离心收集并干燥得到盐酸处理过的多壁碳纳米管；将戊二醛与上述处理后的多壁碳纳米管混合搅拌，离心后用去离子水洗涤，收集后在干燥得到经戊二醛活化的多壁碳纳米管；
8、(2)称取ω-转氨酶和经戊二醛活化的氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶悬浮在缓冲液中，然后加入经戊二醛活化的氨基化多壁碳纳米管进行搅拌，再加入戊二醛，继续搅拌孵育固定，过滤回收即可得到固定化转氨酶。
9、一种固定化转氨酶，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，其中，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应40～200mgω-转氨酶。
10、优选的，固定化转氨酶使用上述制备方法制备。
11、优选的，固定化转氨酶在催化1-乙酰基萘生成(r)-1-(1-萘基)乙胺中的应用。
12、更优选的，以1-乙酰基萘和苯乙胺为底物、以固定化转氨酶为催化剂、以体积浓度为10％的甲醇为助溶剂、以ph值为8的tris-hcl体系为缓冲液进行催化反应，反应结束后对反应液进行分离纯化得到(r)-1-(1-萘基)乙胺。
13、重复上述催化反应，将每批次反应结束后收集的固定化转氨酶加入新的反应混合液中，进行继续催化，直到反应不能完成。采用高效液相色谱法分析产物产率和酶活。
14、本专利技术的有益效果：
15、本专利技术提供了一种固定化转氨酶的制备方法，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，atata@mwcnts-nh2。
16、固定化转氨酶的最佳固定条件为ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应160mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为3.3％；固定化时ph为8，温度为25℃，时间为10min；缓冲液为tris-hcl。在上述最佳固定条件下，固定化酶的酶活性回收率为78.7％。
17、以体积浓度为10％的甲醇为助溶剂，固定化转氨酶具有更高的活性。固定化转氨酶用于催化1-乙酰基萘反应生成(r)-nea，连续反应15个批次后，(r)-nea总产量为1.86g，e.e.p值(产物对映体过量)为99.5％，在非水体系中实现了(r)-nea的克级规模化生产。
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1.一种固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，其中，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应40～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为1～10％；固定化时pH为5～9，温度为4～64℃，时间为5～300min。
2.根据权利要求1所述固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应120～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为2.5～5％；固定化时pH为6～8，温度为15～37℃，时间为5～30min。
3.根据权利要求2所述固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应160mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为3.3％；固定化时pH为8，温度为25℃，时间为10min。
4.根据权利要求1所述固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种固定化转氨酶，其
6.根据权利要求5所述固定化转氨酶，其特征在于，使用权利要求1～4任一所述制备方法制备。
7.权利要求5所述固定化转氨酶在催化1-乙酰基萘生成(R)-1-(1-萘基)乙胺中的应用。
8.据权利要求8所述固定化转氨酶的应用，其特征在于，以1-乙酰基萘和苯乙胺为底物、以固定化转氨酶为催化剂、以体积浓度为10％的甲醇为助溶剂、以pH值为8的Tris-HCl体系为缓冲液进行催化反应，反应结束后对反应液进行分离纯化得到(R)-1-(1-萘基)乙胺。
...【技术特征摘要】
1.一种固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，其中，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应40～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为1～10％；固定化时ph为5～9，温度为4～64℃，时间为5～300min。
2.根据权利要求1所述固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应120～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为2.5～5％；固定化时ph为6～8，温度为15～37℃，时间为5～30min。
3.根据权利要求2所述固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应160mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为3.3％；固定化时ph为8，温度为25℃，时间为...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊，邱帅，崔羽童，梅乐和，吕常江，胡升，赵伟睿，张拥军，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：
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