【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，具体涉及一种高纯度胰蛋白酶的制备方法。
技术介绍
1、胰蛋白酶(trypsin；ec 3.4.21.4)是一种丝氨酸蛋白酶，可特异性的切割碱性氨基酸，酶解赖氨酸及精氨酸c末端形成的肽键，广泛用于重组胰岛素生产、蛋白质的酶解和测序、各种组织的细胞分离等。在医药行业及科学研究等方面具有广泛的应用价值。
2、天然胰蛋白酶，普遍发现于脊椎动物消化系统的丝氨酸蛋白酶，以无活性的胰蛋白酶原(trypsinogen)的形式分泌于胰腺中，当它进入小肠后，在ca2+的存在下，受小肠粘膜分泌的肠激酶作用，lys-ile间的肽键被水解打断，使构象发生变化，成为有活性的胰蛋白酶。
3、采用基因工程方式制备重组胰蛋白酶，需要先用工程菌表达出无活性的胰蛋白酶原，在ca2+的存在下，通过自水解，切割n末端的酶原前肽，激活成为β-胰蛋白酶。β-胰蛋白酶通过自水解作用，可以产生多种由二硫键相连的多链α-胰蛋白酶，α-胰蛋白酶的酶活性低于β-胰蛋白酶，α-胰蛋白酶特异性差，会对蛋白进行错切，会对胰蛋白酶的应用产生影响，因此制备高纯度的β-胰蛋白酶尤为重要。
4、制备高纯度β-胰蛋白酶，一种解决办法是在重组表达过程中，将猪胰蛋白酶的位点进行突变，例如cn110093336a报道，对猪胰蛋白酶第49位，第99位，第107位，至少一个位置进行氨基酸突变。该方法制备的胰蛋白酶，β-胰蛋白酶纯度低于85％，α-胰蛋白酶纯度高于13％。另一种解决办法如cn110093336a提到，对突变后的猪胰蛋白酶进行甲基化修饰，再
5、β-胰蛋白酶与α-胰蛋白酶活力和热稳定性是最主要的差异，其余性质相似，因此β-胰蛋白酶与α-胰蛋白酶比较难分离。目前还未见报道在不对胰蛋白酶进行突变的前提下，能够制备高纯度的β-胰蛋白酶的方法。本领域研究和优化的胰蛋白酶制备方法，使得到的β-胰蛋白酶的比例达到95％以上，即α-胰蛋白酶的比例少于5％。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种，可满足蛋白质质谱分析的高纯度胰蛋白酶的纯化方法，通过该方法得到不仅可以得到高纯度的β-胰蛋白酶，且所得β-胰蛋白酶收率高、活性高，工艺稳定性好，适于大量制备高纯度β-胰蛋白酶。
2、为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，利用阳离子交换色谱层析有效分离α-胰蛋白酶和β-胰蛋白酶，包括以下步骤：
4、s1：取胰蛋白酶粗品，补加终浓度为20-30mm的ca2+缓冲盐，并调节ph至1.5-4.0，样品的电导率不高于10ms/cm；
5、s2：用含有ca2+的a液平衡阳离子交换色谱层析柱不低于4个柱体积，将步骤s1中处理后的胰蛋白酶粗样上样，用a液平衡阳离子交换色谱层析柱不低于2个柱体积；
6、s3：使用a液-b液梯度洗脱，紫外监测，收集主峰流出液，得到的高纯度β-胰蛋白酶，所述b液中含有ca2+和na+。
7、在某些实施例中，所述胰蛋白酶粗品为α-胰蛋白酶比例低于64.4％、β-胰蛋白酶比例高于30％的胰蛋白酶粗品。
8、在某些实施例中，所述高纯度β-胰蛋白酶中β-胰蛋白酶hplc纯度不低于95％。
9、在某些实施例中，所述a液中ca2+的浓度为20-30mm，a液中的ph调节剂的浓度为10-100mm，ph为1.5-4；所述b液中ca2+的浓度为20-30mm，na+的浓度为0.8-1.2m，ph为1.5-4。
10、在某些实施例中，胰蛋白酶粗品为α-胰蛋白酶比例为50.7％、β-胰蛋白酶比例为43.5％的胰蛋白酶粗品。当所述a液中ca2+的浓度为20-30mm，a液中的ph调节剂的浓度为10-100mm，ph为1.5-4；所述b液中ca2+的浓度为20-30mm，na+的浓度为0.8-1.2m，ph为1.5-4，胰蛋白酶粗品经过离子交换层析后，β-胰蛋白酶的hplc纯度均在95％以上，β-胰蛋白酶收率稳定在90％以上。当所述a液中不含ca2+，a液中的ph调节剂的浓度为10-100mm，ph为1.5-4；所述b液中不含ca2+，na+的浓度为0.8-1.2m，ph为1.5-4，胰蛋白酶粗品经过离子交换层析后，β-胰蛋白酶的hplc纯度均在60％以下，β-胰蛋白酶收率均在50％以下。在离子交换层析时，在相同离子强度或电导下洗脱时，a液、b液带上ca2+时β-胰蛋白酶纯度和收率均比a液、b液不带ca2+时要高很多。
11、在某些实施例中，所述a液、b液中的ca2+由可溶解的钙盐提供，选自氯化钙、醋酸钙中的一种或两种。
12、在某些实施例中，所述b液中的na+由可溶解的钠盐提供，选自氯化钠、醋酸钠中的一种或两种。
13、在某些实施例中，ph调节剂选自盐酸或醋酸。
14、在某些实施例中，所述阳离子交换色谱层析柱的填料配基为：-ch2-ch2-ch2-so3-、r-o-ch2-choh-ch2-o-ch2-choh-ch2-so3-中的一种或两种。所述阳离子交换色谱层析柱填料的粒径为10μm-30μm，优选10μm。
15、在某些实施例中，每1l色谱层析填料的胰蛋白酶粗品的载量10～40g，β-胰蛋白酶收率为90％以上。
16、在某些实施例中，所述紫外线的波长为200～280nm。
17、在某些实施例中，所述步骤s3中b液的体积变化范围为20％～40％。
18、相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
19、本专利技术通过一步纯化的方式，将β-胰蛋白酶hplc纯度在50％以下的工业生产用胰蛋白酶，有效分离α-胰蛋白酶和β-胰蛋白酶，纯化至hplc纯度大于95％的β-胰蛋白酶，该方法操作简单，且β-胰蛋白酶收率稳定在90％以上。本专利技术的制备方法具有以下优势。
20、(1)本专利技术对不同来源的胰蛋白酶都能将β-胰蛋白酶hplc纯度提高至95％以上，不同来源的胰蛋白酶其中包括：酵母重组表达的胰蛋白酶、大肠杆菌重组表达的胰蛋白酶、动物提取来源的胰蛋白酶；
21、(2)采用离子交换层析填料，对胰蛋白酶进行纯化制备，将β-胰蛋白酶hplc纯度在50％以下的工业生产用胰蛋白酶，提高β-胰蛋白酶的hplc纯度至95％以上，样品活性明显提高，且β-胰蛋白酶收率稳定在90％以上，纯化后的样品纯度和收率都远高于现有技术所获得的成果。
22、(3)本专利技术筛选出高分辨率的阳离子交换层析填料，在离子交换层析时，a液、b液带上钙离子，β-胰蛋白酶纯度和收率均比a液、b液不带钙离子时要高很多。α-胰蛋白酶和β-胰蛋白酶的性质相近，利用分子量大小、疏水等性质比较难分离；缓冲带上20-30mm钙离子能够稳定β-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶粗品为α-胰蛋白酶比例低于64.4％、β-胰蛋白酶比例高于30％的胰蛋白酶粗品。
3.根据权利要求1所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述高纯度β-胰蛋白酶中β-胰蛋白酶HPLC纯度不低于95％。
4.根据权利要求1所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述A液中Ca2+的浓度为20-30mM，pH为1.5-4；所述B液中Ca2+的浓度为20-30mM，Na+的浓度为0.8-1.2M，pH为1.5-4。
5.根据权利要求1或4所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述A液、B液中的Ca2+由可溶解的钙盐提供，选自氯化钙、醋酸钙中的一种或两种。
6.根据权利要求1或4所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述B液中的Na+由可溶解的钠盐提供，选自氯化钠、醋酸钠中的一种或两种。
7.根据权利要求1或4所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备
8.根据权利要求1-4任一项所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述阳离子交换色谱层析柱的填料配基为：-CH2-CH2-CH2-SO3-、R-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-SO3-中的一种或两种。
9.根据权利要求1-4任一项所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述阳离子交换色谱层析柱填料的粒径为10μm-30μm，优选10μm。
10.根据权利要求1-4任一项所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：每1L色谱层析填料的胰蛋白酶粗品的载量10～40g，β-胰蛋白酶收率为90％以上。
...【技术特征摘要】
1.一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶粗品为α-胰蛋白酶比例低于64.4％、β-胰蛋白酶比例高于30％的胰蛋白酶粗品。
3.根据权利要求1所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述高纯度β-胰蛋白酶中β-胰蛋白酶hplc纯度不低于95％。
4.根据权利要求1所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述a液中ca2+的浓度为20-30mm，ph为1.5-4；所述b液中ca2+的浓度为20-30mm，na+的浓度为0.8-1.2m，ph为1.5-4。
5.根据权利要求1或4所述一种高纯度β-胰蛋白酶制备方法，其特征在于：所述a液、b液中的ca2+由可溶解的钙盐提供，选自氯化钙、醋酸钙中的一种或两种。
6.根据权利要求1或4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：程为良，谭长成，付志成，文海燕，向菊，
申请(专利权)人：重庆艾美迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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