一种重组赖氨酰内肽酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种重组赖氨酰内肽酶突变体及其应用。所述重组赖氨酰内肽酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，所述发生氨基酸突变的位点包括如下的任意一个或多个：R19K、R48K、P86K、N91K、P125K、P184K、S252K，优选为R19K+S252K、P86K+P184K、R48K+N91K+P125K。本发明专利技术固定化效率高，固化API酶活性高，尿素耐受性高，API脱落率低，重复使用20次以上，酶活力保持初始活力80％。酶活力保持初始活力80％。

【技术实现步骤摘要】
一种重组赖氨酰内肽酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及酶固定化
，尤其涉及一种重组赖氨酰内肽酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]赖氨酰内肽酶(Achromobacter protease I，简称API，EC 3.4.21.50)是一种能特异性识别与切割肽链中Lys羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶(Handbook of Proteolytic Enzymes
‑
Academic Press(2013))。最初由Masaki等人从土壤细菌无色杆菌Achromobacterlyticus中分离得到(Biochim Biophys Acta.1981；660(1):44
‑
50.Proteolytic Enzymes:Serine and Cysteine Peptidases,126
–
137.)。API具有广泛的pH(7.0
‑
10.0)耐受性和更强的表面活性剂耐受性(4mol/L尿素、20％乙腈或0.2％SDS溶液中仍有活性)，可特异性地识别和切割肽链中赖氨酸残基，与胰蛋白酶相比具有更高的活性和特异性，是一种重要的工具酶。
[0003]早期API采用野生菌种表达获取(Kuhlman P A,Chen R,Alcantara J,et al.Rapid purification of Lys
‑
C from Lysobacter enzymogenes cultures:A sequential chromatography technique[J].Bioprocess Int,2009,7:28
‑
38.)，因产量有限价格昂贵，限制了其主要用途为单克隆抗体或生物大分子药物的质量肽图分析，蛋白质测序和蛋白组学分析等的检测领域，无法进行工业化领域；为了克服野生菌株表达水平低的缺点，重庆艾美迪生物采用基因重组的方法制备重组赖氨酰内肽酶，目前已经达到年产公斤级的产能水平(www.imed
‑
bio.com)，使API能作为一种工具酶广泛应用于生物制药领域，特别是胰岛素制备和重组多肽产品制备。
[0004]多肽表达由于氨基酸数量往往低于50AA，易被胞内环境中的各种杂酶等因素降解，导致表达量低，或难以表达；因此将肽段与一种易形成包涵体的前肽融合表达，使其在胞内形成包涵体避免被降解；或者将肽段进行串联形成大分子避免被胞内杂酶降解。之后再对重组串联融合蛋白进行API酶切反应。当目标多肽序列中无Lys
‑
C位点进行融合或串联表达时，常在融合蛋白与目标多肽间插如赖氨酰内肽酶酶切的赖氨酸位点，因而可采用API对融合蛋白进行酶切获得目标多肽；当目标多肽中无Lys
‑
C位点且C末端为Lys
‑
C残基时，可将目标多肽进行首位串联表达，再用API将串联多肽逐一酶切成单独的目标多肽。但目前，API酶切反应一般是在水溶液中进行，反应完成后会导致底物、产物和酶难于从溶液中分离出来，酶切产物中酶仍有残留风险，不利于底物产品的质量控制。
[0005]CN112679701A公开了一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途，所述制备方法包括首先通过环氧载体的环氧基团与D
‑
谷氨酸
‑1‑
叔丁酯的氨基进行反应，将D
‑
谷氨酸
‑1‑
叔丁酯修饰到环氧载体上，然后用氨基酸羧基活化剂活化D
‑
谷氨酸
‑1‑
叔丁酯，获得活化的D
‑
谷氨酸
‑1‑
叔丁酯修饰的改性环氧载体；用该改性环氧载体与Lys
‑
C孵育，获得固定Lys
‑
C；再利用固定化Lys
‑
C制备胰岛素类似物。但该专利所述固化基质只能是环氧载体基质，且限定了只能用D
‑
谷氨酸
‑1‑
叔丁酯的氨基进行改性，然后实现固化赖氨酸内肽酶，限
定了该方法的商业化生产价值；并且该方法得到的酶活活性为15.3U/g，重复使用10次后酶活保留率为70％，其重复使用后的酶活保留率较低，限定了其在工业化生产中可重复使用的次数。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中所存在的固化效率低、固化后酶活性低以及重复次数少等不足之处，本专利技术提供了一种重组赖氨酰内肽酶突变体及其应用，将野生型API的部分氨基酸定向突变位Lys后增加固化偶联位点，然后以
‑
COOH、环氧基、NSH酯的任意一种为活化端基的载体，以直链柔性臂进行连接实现固化API突变体；本方法酶固定化效率高，固化后API酶活性高，脱落率低，重复使用20次以上酶活力保持初始活力90％。本专利技术还提供了一种固定化API突变体在制备目标多肽中的应用，扩展固化API突变体的工业化应用价值。
[0007]本专利技术一方面，提供一种重组赖氨酰内肽酶突变体，所述重组赖氨酰内肽酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，所述发生氨基酸突变的位点包括如下的任意一个或多个：R19K、R48K、P86K、N91K、P125K、P184K、S252K，优选为R19K+S252K、P86K+P184K、R48K+N91K+P125K。
[0008]本专利技术另一方面，提供一种DNA分子，所述DNA分子编码上述重组赖氨酰内肽酶突变体。
[0009]本专利技术又一方面，提供一种重组载体，所述重组载体包括上述DNA分子。
[0010]本专利技术再一方面，提供一种固定化重组赖氨酰内肽酶，所述固定化重组赖氨酰内肽酶包括上述重组赖氨酰内肽酶突变体。
[0011]进一步地，所述固定化重组赖氨酰内肽酶包括重组赖氨酰内肽酶突变体和柔性臂连接的固相载体，所述重组赖氨酰内肽酶突变体和柔性臂连接的固相载体通过共价键连接；
[0012]其中，所述柔性臂连接的固相载体包括柔性臂和固相载体，所述柔性臂和固相载体通过共价键连接；
[0013]优选地，所述固相载体为具有活化端基的固相载体，所述活化端基包括COOH基、环氧基、NHS酯中的一种，更优选地，所述固相载体包括葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酸酯微球、聚丙烯酸酯磁珠中的一种；
[0014]优选地，所述柔性臂直链长度应不低于6C，且包括氨基端和羧基端，更优选地，所述柔性臂为6
‑
氨基己酸，10
‑
氨基癸酸，12
‑
氨基十二酸或肽链。
[0015]本专利技术再一方面，提供一种所述的固定化重组赖氨酰内肽酶的制备方法，包括以下步骤：
[0016]S1：将固相载体与柔性臂连接，得到柔性臂连接的固相载体；
[0017]S2：将柔性臂连接的固相载体与重组赖氨酰内肽酶突变体进行固定化反应，得到固定化重组赖氨酰内肽酶。
[0018]进一步地，步骤S1中，所述固相载体:柔性臂的摩尔比为1:5
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组赖氨酰内肽酶突变体，其特征在于：所述重组赖氨酰内肽酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，所述发生氨基酸突变的位点包括如下的任意一个或多个：R19K、R48K、P86K、N91K、P125K、P184K、S252K，优选为R19K+S252K、P86K+P184K、R48K+N91K+P125K。2.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子编码权利要求1所述的重组赖氨酰内肽酶突变体。3.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包括权利要求2所述的DNA分子。4.一种固定化重组赖氨酰内肽酶，其特征在于：所述固定化重组赖氨酰内肽酶包括权利要求1所述的重组赖氨酰内肽酶突变体。5.如权利要求4所述的一种固定化重组赖氨酰内肽酶，其特征在于：所述固定化重组赖氨酰内肽酶包括重组赖氨酰内肽酶突变体和柔性臂连接的固相载体，所述重组赖氨酰内肽酶突变体和柔性臂连接的固相载体通过共价键连接；其中，所述柔性臂连接的固相载体包括柔性臂和固相载体，所述柔性臂和固相载体通过共价键连接；优选地，所述固相载体为具有活化端基的固相载体，所述活化端基包括COOH基、环氧基、NHS酯中的一种，更优选地，所述固相载体包括葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酸酯微球、聚丙烯酸酯磁珠中的一种；优选地，所述柔性臂的直链长度不低于6C，且包括氨基端和羧基端，更优选地，所述柔性臂为6
‑
氨基己酸，10
‑
氨基癸酸，12
‑
氨基十二酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭长成，唐光辉，程为良，邓豪，
申请(专利权)人：重庆艾美迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：