人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法。该人工设计的赖氨酰内切酶是将野生型赖氨酰内切酶中的第167位、第193位和第207位中的至少一个氨基酸进行如下突变得到：第167位的缬氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；第193位的丝氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸；第207位的甘氨酸突变为缬氨酸或亮氨酸。本发明专利技术提供的赖氨酰内切酶酶活高，可达到8000U/L以上，且具有稳定性高的优点。且具有稳定性高的优点。且具有稳定性高的优点。

【技术实现步骤摘要】
人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法。

技术介绍

[0002]赖氨酰特异性内切酶是一条由268个氨基酸残基构成的多肽，其中肽链内部含有三个二硫键(Cys6
‑
Cys216，Cys12
‑
Cys80，Cys36
‑
Cys58)，由His57、Asp113和Ser194构成的三联体决定了该酶的催化活性，而Asp225决定了其对赖氨酸的特异选择性。
[0003]赖氨酰特异性内切酶与牛胰蛋白酶的氨基酸序列虽然只有20％的同源性，但是决定酶催化活性以及赖氨酸特异性相关的氨基酸序列和空间结构完全一致，因此赖氨酰特异性内切酶被归为胰蛋白酶家族。与牛胰蛋白酶相比，赖氨酰特异性内切酶对赖氨酸碳端的选择性更高，并且有10倍于胰蛋白酶的活性、较广的最适pH范围(pH8.5～10.5)及在4M的尿素或0.1％的SDS中依然正常的稳定性。这些特性使赖氨酰特异性内切酶成为生物医药生产中一种非常有用的工具酶。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工设计的赖氨酰内切酶，其特征在于：所述的人工设计的赖氨酰内切酶任选如下一种：是将野生型赖氨酰内切酶中的第167位的缬氨酸突变为亮氨酸；或是，将野生型赖氨酰内切酶中的第193位的丝氨酸突变为甘氨酸和第207位的甘氨酸突变为亮氨酸中的至少一个氨基酸突变与将第167位的缬氨酸突变为亮氨酸组合得到；或是，将野生型赖氨酰内切酶中的第167位的缬氨酸突变为亮氨酸、第193位的丝氨酸突变为丙氨酸、第207位的甘氨酸突变为亮氨酸组合得到；或是，将野生型赖氨酰内切酶中的第167位的缬氨酸突变为亮氨酸、第193位的丝氨酸突变为甘氨酸、第207位的甘氨酸突变为缬氨酸组合得到；或是，将野生型赖氨酰内切酶中的第167位的缬氨酸突变为亮氨酸、第193位的丝氨酸突变为丙氨酸、第207位的甘氨酸突变为缬氨酸组合得到；所述的野生型赖氨酰内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。2.根据权利要求1所述的人工设计的赖氨酰内切酶，其特征在于：所述的人工设计的赖氨酰内切酶还包括如下情形：是将第30位、第49位、第106位和第155位赖氨酸中一个或多个突变为精氨酸。3.编码权利要求1～2任一项所述的人工设计的赖氨酰内切酶的核苷酸序列。4.一种人工设计的赖氨酰内切酶原，其特征在于：由信号肽、N端前导肽及权利要求1
‑
2任意一项所述的人工设计的赖氨酰内切酶组成；所述的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的N端前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。5.编码权利要求4的人工设计的赖氨酰内切酶原的核苷酸序列。6.一种表达人工设计的赖氨酰内切酶原的重组载体，其特征在于：将权利要求5所述的核苷酸序列重组于表达载体上得到。7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：所述的表达载体为pE...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘合栋，曹春来，刘学明，陈康月，梁雄基，周翠，何秀仪，
申请(专利权)人：珠海联邦制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：