【技术实现步骤摘要】
本申请属于植物基因工程，尤其涉及一种基于转基因植株的her-2抗体生产方法。
技术介绍
1、her-2 (人类表皮生长因子受体2，p185，erbb-2)是由癌基因neu/erbb-2/her-2编码的细胞表面跨膜糖蛋白，已发现在十余种癌症中表达显著增高，尤其是乳腺癌和卵巢癌，有25-30％为her-2过表达型，此类型肿瘤表现出恶性程度高、肿瘤增殖和恶化速度快、预后差且容易复发，特别是它们对传统的化疗和放疗等疗法不敏感，危害性更大。
2、以her-2为靶点的抗p185neu/erbb-2/her-2抗体药物赫赛汀（herceptin,trastuzumab）能有效的下调her-2的表达，明显的抑制her-2过表达肿瘤的生长甚至使肿瘤完全逆转，采用抗her-2抗体联合化疗已成为国际公认的治疗her-2过表达型转移癌症的一线药物，治疗反应率达45-65%，生存期延长一倍。
3、目前用于基因工程抗体表达的系统主要包括：大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物表达系统等。
4、其中，大肠杆菌表达系统主要优点是成本低、周期短、易于操作，但是缺少磷酸化、糖基化等加工机制，不适合表达结构复杂的蛋白质。而酵母有较强的蛋白折叠和翻译后加工修饰能力，与哺乳动物表达体系相比能在简单培养条件下快速生长和高密度发酵，但糖基化修饰与人类明显不同，目前已对pichia pastoris进行人源n-糖基化改造（naturebiotechnology, 2006, 24(2): 210-215）。
5、昆虫
6、哺乳动物细胞是目前常用的生产抗体的表达系统，糖基化等翻译后修饰比较接近人类，被用来生产临床应用的抗体和全人源化抗体，但是哺乳动物细胞生产成本较高。
7、植物可以利用简单的无机物、阳光、水等进行大规模生长培养，培养成本低，不需要特殊的反应设备，易于放大培养，人工生产成本低。可以用植物的根、茎、叶、果实、整棵植株、藻类、悬浮植物细胞、hairy roots等来表达外源蛋白。
8、许多动物源的蛋白业已在植物中表达生产，如在烟草中表达治疗性单克隆抗体、疫苗、细胞因子、血液蛋白成分等治疗性重组蛋白以及工业用酶，生物多聚物等。蛋白表达水平可以达到总可溶性（tsp）的0.01%（plant biotechnol j, 2009. 7: 537-39），甚至高达可溶性蛋白的25% (plant cellrep, 2007. 26: p. 1151-9) 以及247mg/l(biotechnol prog, 2005. 21:728-34)。
9、国内武汉大学和中山大学已分别用稻米和烟草悬浮细胞生产人白蛋白表达量分别达到每公斤稻米含2.75g人白蛋白 (proc natl acad sci u s a, 2011. 108(47):19078-19083 )，11.88 g/ml细胞悬浮液 ( journal of biotechnology, 2011. 155:164-172 )，除此之外，武汉大学还表达了重组人抗胰蛋白酶(osraat)、重组人酸性成纤维细胞生长因子(osrafgf)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(osrbfgf)，吉林农业大学用番茄表达内表皮生长因子等 (西北农林科技大学学报（自然科学版）,2012. 40(1): p. 141-146 )，以及在番茄表达了抗狂犬病病毒的疫苗，以及霍乱毒素ｂ亚单位（biotechnologyadvances. 29: p. 210-222）。
10、由此，迫切需要提供合适的技术方案来实现her-2抗体在植物中的表达。
技术实现思路
1、本申请实施例提供一种番茄表达her-2抗体基因的方法，旨在解决现有her-2抗体生产方法所存在的缺陷。
2、第一方面，本申请实施例提供了一种重组表达质粒。该重组表达质粒包括：her-2抗体基因以及真核细胞表达原件，以使所述her-2抗体基因可在植物细胞中内表达。
3、第二方面，本申请实施例还提供了一种转基因番茄的获得方法。所述方法包括：使用真核表达载体转化农杆菌；所述真核表达载体内含有her-2抗体基因序列；使用转化后的农杆菌侵染番茄愈伤组织；在农杆菌侵染后的番茄中，筛选表达her-2抗体基因的转基因番茄植株。
4、可选地，所述真核表达载体通过如下方法构建：通过pcr扩增her-2基因片段；对真核表达载体和her-2基因片段分别用xbai和saci酶进行双酶切，并回收酶切片段；使用t4连接酶对回收的酶切片段进行连接；使用连接产物转化dh5α大肠杆菌，挑取阳性克隆并用pcr验证，以获得所述真核表达载体。
5、可选地，所述通过pcr扩增her-2基因片段时，使用的正向引物为seq id no.1；使用的反向引物为seq id no.2。
6、可选地，所述使用真核表达载体转化农杆菌，具体包括：将构建好的植物表达载体转入农杆菌，在含有卡那霉素与利福平(浓度均为50 mg/l)的lb固体培养基上划线；在28°c下，暗培养两天，挑取单菌落并通过pcr验证，获得转化成功的农杆菌。
7、可选地，所述在农杆菌侵染后的番茄中，筛选表达her-2抗体基因的转基因番茄植株，具体包括：基于nptii标记基因，通过pcr扩增筛选阳性的转基因番茄植株。
8、可选地，所述通过pcr扩增筛选阳性的转基因番茄植株时，使用的正向引物为seqid no.3；使用的反向引物为seq id no.4。
9、本申请的至少一个有益效果是：获得了能够表达her-2抗体基因的转基因番茄植株。该转基因番茄植株可以在her-2抗体的生产应用方面发挥重要作用。
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1.一种重组表达质粒，其特征在于，包括：Her-2抗体基因以及真核细胞表达原件，以使所述Her-2抗体基因可在植物细胞中内表达。
2.一种转基因番茄的获得方法，其特征在于，所述方法包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体通过如下方法构建：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述通过PCR扩增Her-2基因片段时，使用的正向引物为SEQ ID No.1；使用的反向引物为SEQ ID No.2。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述使用真核表达载体转化农杆菌，具体包括：
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述在农杆菌侵染后的番茄中，筛选表达Her-2抗体基因的转基因番茄植株，具体包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述通过PCR扩增筛选阳性的转基因番茄植株时，使用的正向引物为SEQ ID No.3；使用的反向引物为SEQ ID No.4。
8.一种Her-2抗体的生产方法，其特征在于，包括：
【技术特征摘要】
1.一种重组表达质粒，其特征在于，包括：her-2抗体基因以及真核细胞表达原件，以使所述her-2抗体基因可在植物细胞中内表达。
2.一种转基因番茄的获得方法，其特征在于，所述方法包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体通过如下方法构建：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述通过pcr扩增her-2基因片段时，使用的正向引物为seq id no.1；使用的反向引物为seq id no.2。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：陆洲，陆景，郭子晴，
申请(专利权)人：合肥润初生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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