一种利用D-葡萄糖为底物生物合成异戊醇的方法技术

技术编号：40581013 阅读：6 留言：0更新日期：2024-03-06 17:24

本发明专利技术提供一种利用D‑葡萄糖为底物生物合成异戊醇的方法。涉及生物化工领域，其特征在于，以解脂耶氏酵母Po1g菌株为底盘细胞，通过筛选不同来源的酶优化Harris途径，在YPD培养基中利用D‑葡萄糖生物合成异戊醇。Harris途径涉及醇脱氢酶(EC 1.1.1.‑)和酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)，利用上述2种酶构建共表达质粒，构建出产异戊醇的工程菌Po1g/pYLXP’‑kivd‑yqhd。结果表明，菌株Po1g/pYLXP’‑kivd‑yqhd可以在SD‑leu培养基中催化2g/L的α‑酮异己酸为底物生物合成51.9mg/L异戊醇；在YPD培养基中以40g/L的D‑葡萄糖为底物生物合成0.312mg/L异戊醇，是Po1g/pYLXP’菌株异戊醇产量的1.53倍。本发明专利技术是一种优化解脂耶氏酵母Po1g菌株Harris途径来提高生物合成异戊醇产量的方法，进一步的基因线路及发酵工艺优化有望大幅提高异戊醇产量。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化工领域，具体涉及一种利用d-葡萄糖为底物生物合成异戊醇的方法。

技术介绍

1、异戊醇，又名3-甲基-1-丁醇，分子式为c5h12o，分子量88.148，结构式为(ch3)2chch2ch2oh。异戊醇的熔点是-117℃，沸点是131.2℃。常温常压下异戊醇为无色液体，具有杂醇油味，微溶于水，可混溶于乙醚、苯、乙醚、氯仿、石油醚，易溶于丙酮，溶于多数有机溶剂。异戊醇在液体燃料、食用香料、日用精油等领域广泛应用。

2、目前。异戊醇生物合成集中于以谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母等微生物为底盘细胞，利用ehrlich途径转化亮氨酸为异戊醇。但相关微生物对异戊醇的耐受性低，导致工程菌应用于工业化规模生产时困难，而解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)相比于酿酒酵母等微生物，抗逆性强，能够适应多种恶劣环境，如低温、高盐、低ph等；并且底物谱广，能够利用各种疏水和亲水碳源，如葡萄糖、甘油、乙醇、烷烃类和废弃食用油等。因此，解脂耶氏酵母的强抗逆性使其具备高产异戊醇的潜力。

技术实现思路

1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种优化解脂耶氏酵母po1g菌株harris途径并以d-葡萄糖为底物合成异戊醇的方法，通过筛选不同来源的脱氢酶(ec 1.1.1.-)和酮酸脱羧酶(ec 4.1.1.1)，构建共表达质粒，构建harris途径优化的工程菌，从而提高以d-葡萄糖生物合成异戊醇的效率。

2、为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：</p>

3、本专利技术提供了一种利用d-葡萄糖生物合成异戊醇的方法，所述异戊醇合成方法以解脂耶氏酵母为底盘细胞，构建工程菌利用d-葡萄糖生物合成异戊醇。

4、可选的，所述的解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母po1g。

5、可选的，所述的筛选合成异戊醇菌株的方法如下：

6、(1)脱氢酶筛选。将上述不同来源的脱氢酶编码基因(ypl088w，seq id no:1)、(ylypl088w，seq id no:2)、(yqhd，seq id no:3)、(scadh2，seq id no:4)、(scadh7，seqid no:5)、(scadh4，seq id no:6)、(scadh6，seq id no:7)、(scadh1，seq id no:8)、(scadh3，seq id no:9)、(scadh5，seq id no:10)、(yladh2_01，seq id no:11)、(yladh2_02，seq id no:12)、(yladh2_03，seq id no:13)、(yladh2_04，seq id no:14)、(yladh3seq id no:15)分别使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)克隆到载体pylxp’的snabi酶切位点(所用引物见表1)，分别转化重组质粒至解脂耶氏酵母po1g得到工程菌po1g/pylxp’-scadh2、po1g/pylxp’-scadh7、po1g/pylxp’-scadh4、po1g/pylxp’-scadh6、po1g/pylxp’-scadh1、po1g/pylxp’-scadh3、po1g/pylxp’-scadh5、po1g/pylxp’-ypl088w、po1g/pylxp’-yladh2_01、po1g/pylxp’-yladh2_02、po1g/pylxp’-yladh2_03、po1g/pylxp’-yladh2_04、po1g/pylxp’-yladh3、po1g/pylxp’-ylypl088w、po1g/pylxp’-yqhd。通过筛选以上菌株，催化异戊醛合成异戊醇能力最高的2个菌株为po1g/pylxp’-scadh2、po1g/pylxp’-yqhd。

7、(2)酮酸脱羧酶筛选。将上述不同来源的酮酸脱羧酶编码基因(ylpdc1，seq idno:16)、(kivd，seq id no:17)、(gokdc，seq id no:18)使用t4连接酶(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)分别连接到载体pylxp’-adh2/pylxp’-yqhd的nhei/sali酶切位点之间，得到6个重组质粒pylxp’-kivd-adh2、pylxp’-kivd-yqhd、pylxp’-gokdc-adh2、pylxp’-gokdc-yqhd、pylxp’-ylpdc1-adh2、pylxp’-ylpdc1-yqhd(如图2所示)。将重组质粒转化至解脂耶氏酵母po1g中，即得到6种重组解脂耶氏酵母菌株：po1g/pylxp’-kivd-adh2、po1g/pylxp’-kivd-yqhd、po1g/pylxp’-gokdc-adh2、po1g/pylxp’-gokdc-yqhd、po1g/pylxp’-ylpdc1-adh2、po1g/pylxp’-ylpdc1-yqhd。

8、可选的，所述的途径编码基因表达调控均由tef启动子和xpr2t终止子控制。

9、可选的，转化α-酮异己酸为异戊醇的条件为：在sd-leu培养基30℃、200rpm条件下培养2d进行活化，以2％(v/v)的接种量转接到装有25ml新鲜的sd-leu c/n 80培养基中，细胞生长至指数期间将其进行收集。将发酵的培养液在4℃、5000rpm条件下离心收集菌体。然后使用100mm、ph6的磷酸缓冲液重悬菌体，即得到静息细胞。并通过外源添加2g/lα-酮异己酸、5mm mgcl2、1.5mm二磷酸硫胺(thdp)作为底物，用gc检测异戊醇的生成。

10、(3)异戊醇合成效率显著增强的工程菌：po1g/pylxp’-kivd-yqhd重组菌株。利用d-葡萄糖生产异戊醇的条件为：在sd-leu培养基30℃、200rpm条件下培养2d进行活化，以2％(v/v)的接种量转接到25ml的ypd(c/n80，40g/l d-葡萄糖)培养基中，30℃反应3d，gc检测异戊醇的生成。

11、可选的，所述的底物d-葡萄糖的浓度为40g/l。

12、可选的，所述的转化条件为30℃反应3d。

13、相比于现有的技术，本专利技术具有以下有益效果：

14、1：本专利技术通过筛选研究中常用的多种脱氢酶、酮酸脱羧酶，优化解脂耶氏酵母po1g菌株的harris途径，为解脂耶氏酵母po1g株系在异戊醇生产研发上提供指导。

15、2.本专利技术所述的工程菌po1g/pylxp’-kivd-yqhd可以在sd-leu培养基中催化2g/l的α-酮异己酸为底物生物合成51.9mg/l异戊醇；在ypd培养基中以40g/l的d-葡萄糖为底物生物合成0.312mg/l异戊醇，是po1g/pylxp’菌株异戊醇产量的1.53倍。

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【技术保护点】

1.一种利用葡萄糖为底物生物合成异戊醇的方法。其特征在于，以α-酮异己酸为底物，以解脂耶氏酵母为底盘细胞，通过筛选不同来源的脱氢酶(EC 1.1.1.-)和酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)来优化Harris途径，即催化α-酮异己酸转化为异戊醇的效率，获得以葡萄糖为底物生物合成异戊醇的工程菌(反应过程如图1所示)。

2.根据权利要求1所述脱氢酶(EC 1.1.1.-)具体包括：(1)不同来源的醇脱氢酶(ADH，EC 1.1.1.1)；(2)Saccharomyces cerevisiae BY4741来源的醛酮还原酶编码基因(YPL088W，SEQ ID NO:1)；(3)Yarrowia lipolytica Po1g来源的醛酮还原酶编码基因(YlYPL088W，SEQ ID NO:2)；(4)Escherichia coli JM109来源的NADPH依赖性醛还原酶编码基因(yqhD，EC 1.1.1.2，SEQ ID NO:3)。

3.根据权利要求1、权利要求2所述醇脱氢酶(ADH，EC 1.1.1.1)。主要包括：(1)来源于Saccharomyce

4.根据权利要求1所述的不同来源的酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)。主要来源包括：(1)来源于Yarrowia lipolytica Po1g的丙酮酸脱羧酶编码基因(YLPDC1，SEQ ID NO:16)；(2)来源于Lactococcus Lactis的(Kivd，SEQ ID NO:17)；(3)来源于Gluconobacter oxydans的(GoKDC，SEQ ID NO:18)。

5.根据权利要求1所述的优化Harris途径，其特征在于，以质粒pYLXP’为上述转化途径的表达载体，构建出含有所有途径基因的重组质粒。

6.根据权利要求1、权利要求5，以解脂耶氏酵母Po1g为表达宿主，将重组质粒转化到解脂耶氏酵母Po1g中，得到含有所有途径基因的工程菌株。

7.根据权利要求1所述的优化Harris途径和权利要求6所述的重组工程菌株，其特征在于，所使用的转化条件如下：(1)在SD-leu培养基30℃、200rpm条件下培养2d进行活化，以2％(v/v)的接种量转接到装有25mL新鲜的SD-leu(C/N＝80)培养基中，细胞生长2-3d将其进行离心收集。(2)在4℃、5000rpm条件下离心8min收集菌体，使用100mM、pH 6的磷酸缓冲液重悬菌体，即得到静息细胞。(3)分别添加2g/L的α-酮异己酸或异戊醛为底物，30℃、200rpm条件下转化4小时；(4)使用气相色谱仪检测异戊醇的生成。

8.根据权利要求1所述的异戊醇合成方法和权利要求5所述的重组工程菌株，其特征在于，所使用的转化条件如下：(1)在SD-leu培养基30℃、200rpm条件下培养2d进行活化，以2％(v/v)的接种量转接到25mL含40g/L葡萄糖的YPD(C/N＝80)培养基中，30℃反应3d；(2)使用气相色谱仪检测异戊醇的生成。

9.根据权利要求1、权利要求7、权利要求8所述的异戊醇合成方法。其特征在于，筛选过程如下：(1)筛选含有不同来源的醇脱氢酶编码基因的工程菌，结果能催化异戊醛合成异戊醇酶活力最高的为Po1g/pYLXP’-yqhD；(2)筛选含有醇脱氢酶编码基因(yqhD、GoKDC)并串联不同来源酮酸脱羧酶编码基因的菌株，能催化α-酮异己酸合成异戊醇活力最高的菌株为Po1g/pYLXP’-Kivd-yqhD；(3)工程菌Po1g/pYLXP’-yqhD在YPD培养基中以40g/L的D-葡萄糖为底物，30℃反应3d的异戊醇产量为0.312mg/L，是Po1g/pYLXP’菌株异戊醇产量的1.53倍。

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【技术特征摘要】

1.一种利用葡萄糖为底物生物合成异戊醇的方法。其特征在于，以α-酮异己酸为底物，以解脂耶氏酵母为底盘细胞，通过筛选不同来源的脱氢酶(ec 1.1.1.-)和酮酸脱羧酶(ec4.1.1.1)来优化harris途径，即催化α-酮异己酸转化为异戊醇的效率，获得以葡萄糖为底物生物合成异戊醇的工程菌(反应过程如图1所示)。

2.根据权利要求1所述脱氢酶(ec 1.1.1.-)具体包括：(1)不同来源的醇脱氢酶(adh，ec 1.1.1.1)；(2)saccharomyces cerevisiae by4741来源的醛酮还原酶编码基因(ypl088w，seq id no:1)；(3)yarrowia lipolytica po1g来源的醛酮还原酶编码基因(ylypl088w，seq id no:2)；(4)escherichia coli jm109来源的nadph依赖性醛还原酶编码基因(yqhd，ec 1.1.1.2，seq id no:3)。

3.根据权利要求1、权利要求2所述醇脱氢酶(adh，ec 1.1.1.1)。主要包括：(1)来源于saccharomyces cerevisiae by4741的adh编码基因(scadh2，seq id no:4)、(scadh7，seqid no:5)、(scadh4，seq id no:6)、(scadh6，seq id no:7)、(scadh1，seq id no:8)、(scadh3，seq id no:9)和(scadh5，seq id no:10)；(2)来源于yarrowia lipolytica po1g的adh编码基因(yladh2_01，seq id no:11)、(yladh2_02，seq id no:12)、(yladh2_03，seqid no:13)、(yladh2_04，seq id no:14)、(yladh3，seq id no:15)。

4.根据权利要求1所述的不同来源的酮酸脱羧酶(ec 4.1.1.1)。主要来源包括：(1)来源于yarrowia lipolytica po1g的丙酮酸脱羧酶编码基因(ylpdc1，seq id no:16)；(2)来源于lactococcus lactis的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许敬亮，古仕明，吕迎珠，李西子，吕永坤，熊文龙，张申，赵安琪，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：

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