【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物，特别是涉及一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna及其制备方法和应用。
技术介绍
1、白蜡窄吉丁(emerald ash borer，eab，agrilus planipennis fairmaire)，又名梣小吉丁、花曲柳窄吉丁，属鞘翅目(coleoptera)吉丁甲科(buprestidae)窄吉丁属(agrilus)，危害木犀科(oleaceae)白蜡属(fraxinus)树木。主要危害引进的北美白蜡树种，如美国红梣(洋白蜡，fraxinus pennsylvanica marsh.)、毡毛梣(绒毛白蜡，f.velutina torr)与美国白蜡(f.americana linn.)等，已成为重要的国际检疫性蛀干害虫之一。因此，白蜡窄吉丁的防治受到了林业昆虫学家的关注。
2、白蜡窄吉丁是蛀干类害虫，幼虫取食隐蔽性强，很难用常规的杀虫剂触碰并杀灭，防治起来比较困难。目前针对白蜡窄吉丁的有效的防治方法也十分有限。rna干扰作为一种具有应用前景的新型害虫防治技术，在白蜡窄吉丁防控中具有较好的潜力。蛋白酶β亚基是蛋白酶体中的一个重要组成部分，它在蛋白质降解中发挥着关键的作用。蛋白酶体亚单位β参与了调控蛋白质的降解过程,同时也参与了细胞的信号传导和调节机制，可促进蛋白质的降解速率，保证细胞的正常代谢和运作。prosβ6基因沉默可导致昆虫停止进食，同时代谢物积累并致死，是害虫rnai的良好靶标。但目前没有能有效沉默白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna。
技术实现思
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna及其制备方法和应用。本专利技术提供的dsrna能高效沉默白蜡窄吉丁prosβ6基因，注射后第3天的相对表达量降低了89.69％，随着时间的增加，dsrna沉默效果持续存在。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna，所述dsrna由第一rna分子和第二rna分子组成；所述第一rna分子和第二rna分子互补配对；所述第一rna分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术提供了一种制备上述技术方案所述dsrna的引物组，所述引物组包括第一引物对和第二引物对；
5、所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述第一引物对的下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；
6、所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述第二引物对的下游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。
7、本专利技术提供了上述技术方案所述dsrna的制备方法，包括以下步骤：
8、以白蜡窄吉丁的cdna为模板，利用上述技术方案所述引物组中的第一引物对进行第一pcr扩增，得到第一合成模板；
9、以白蜡窄吉丁的cdna为模板，利用上述技术方案所述引物组中的第二引物对进行第二pcr扩增，得到第二合成模板；
10、利用所述第一合成模板和第二合成模板进行dsrna合成，得到所述第一rna分子和第二rna分子；
11、将所述第一rna分子和第二rna分子复性，得到所述dsrna。
12、优选的，所述第一pcr扩增和第二pcr扩增的反应程序均包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
13、本专利技术提供了上述技术方案所述的dsrna或利用上述技术方案所述的引物组制备得到的dsrna或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的dsrna在防治白蜡窄吉丁中的应用。
14、本专利技术提供了上述技术方案所述的dsrna或利用上述技术方案所述的引物组制备得到的dsrna或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的dsrna在制备防治白蜡窄吉丁的制剂中的应用。
15、本专利技术提供了一种防治白蜡窄吉丁的制剂，所述制剂包括上述技术方案所述的dsrna或利用上述技术方案所述的引物组制备得到的dsrna或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的dsrna。
16、优选的，所述dsrna的有效剂量≥3μg/只。
17、有益效果：
18、本专利技术提供了一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna，所述dsrna由第一rna分子和第二rna分子组成；所述第一rna分子和第二rna分子互补配对；所述第一rna分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。本专利技术提供的dsrna能高效沉默白蜡窄吉丁prosβ6基因，注射后第3天的相对表达量降低了89.69％，随着时间的增加，dsrna沉默效果持续存在，能够导致白蜡窄吉丁生长发育受到限制，影响成虫进一步活动和繁育，最终达到防治的效果，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。
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1.一种靶向白蜡窄吉丁Prosβ6基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA由第一RNA分子和第二RNA分子组成；所述第一RNA分子和第二RNA分子互补配对；所述第一RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种制备权利要求1所述dsRNA的引物组，其特征在于，所述引物组包括第一引物对和第二引物对；
3.权利要求1所述dsRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一PCR扩增和第二PCR扩增的反应程序均包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
5.权利要求1所述的dsRNA或利用权利要求2所述的引物组制备得到的dsRNA或利用权利要求3或4所述制备方法制备得到的dsRNA在防治白蜡窄吉丁中的应用。
6.权利要求1所述的dsRNA或利用权利要求2所述的引物组制备得到的dsRNA或利用权利要求3或4所述制备方法制备得到的dsRNA在制备防治白蜡窄吉丁的制剂中的应用。
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1.一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna，其特征在于，所述dsrna由第一rna分子和第二rna分子组成；所述第一rna分子和第二rna分子互补配对；所述第一rna分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种制备权利要求1所述dsrna的引物组，其特征在于，所述引物组包括第一引物对和第二引物对；
3.权利要求1所述dsrna的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一pcr扩增和第二pcr扩增的反应程序均包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
【专利技术属性】
技术研发人员：张苏芳，樊智智，张荣，陈静，孔祥波，张真，刘福，方加兴，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所国家林业和草原局世界自然遗产保护研究中心，
类型：发明
国别省市：
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