【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸提取，具体涉及一种植物基因组dna快速提取试剂及其应用。
技术介绍
1、转基因作物的推广和种植产生了可观的经济和生态环境效益，其潜在风险却也饱受争议，因此，快速、准确地对转基因进行鉴定对转基因产品标识和市场监管具有十分重要的意义。基于蛋白分析的转基因检测试纸条法是目前转基因检测的主流方法，操作简单，可以快速判读结果，但是试纸条法需要特异性抗体，往往只能检测有限种类的转基因产品，例如抗虫转基因检测试纸只能检测抗虫转基因；抗除草剂转基因检测试剂盒只能检测抗除草剂转基因。
2、基因是dna中真正能够发挥遗传效应的dna片段，不同基因的碱基组成不同。基于核酸分析的转基因检测方法通过检测某基因上特定的dna序列，即可得知检测样本中是否含有此基因。与基于蛋白分析方法相比，基于核酸分析的方法可检测靶点更宽泛，除了可以检测转入的表达基因，还可以检测转基因的通用元件，如camv35s启动子、nos终止子等。这种方法可以用于转基因产品快速筛选，判断样品中是否含有转基因成分，或者为进一步鉴定转基因提供线索，缩小检测范围，具有更高的通用性。
3、获得高纯度核酸样品是保证核酸分析准确性的前提，目前植物基因组dna提取方法主要是ctab法和硅胶柱吸附法。ctab(十六烷基三甲基溴化铵)作为阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来，随后将沉淀溶于高盐溶液中，通过有机溶剂抽提去除蛋白等杂质后加入乙醇沉淀，可使核酸分离出来。但是该方法需要用到氯仿、异丙醇等毒性有机溶剂，且操作繁琐。
4、
5、上述方法无法满足快速、大批量的转基因作物现场检测需求。因此，如何简化植物基因组dna提取工艺，加快核酸扩增反应进程是本领域技术人员需要解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种植物基因组dna快速提取试剂和基于环介导等温扩增的核酸检测方法，广泛适用于各种农作物的dna提取和核酸检测，能够快速有效、低成本无污染地实现现场快速检测，解决现有方法存在的dna提取过程繁琐、使用毒性有机试剂、核酸扩增检测耗时等问题。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种植物基因组dna快速提取试剂，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.3-1m，尿素3-5m，tris-hcl 0.08-0.12m，乙二胺四乙酸二钠0.03-0.07m，余量为水。
4、各组分的作用机理说明：
5、0.3-1m盐酸胍：盐酸胍作为一种离液盐，能快速破坏细胞膜，释放核酸；能使蛋白质变性，抑制dnase的活性，减少dna的降解，且能减少缠绕在dna上的蛋白。目前，市面上的盐酸胍裂解液中盐酸胍的工作浓度为4-8m，这种高浓度的盐酸胍会抑制后续的核酸扩增反应，需要经过纯化去除。本专利技术提出了0.3-1m的浓度作为盐酸胍在裂解液中的工作浓度。试验结果表明，该工作浓度条件下可实现植物细胞的有效裂解以及核酸物质释放；裂解上清液无需经过纯化可直接用于后续的等温扩增反应。具体的，以1:12.5的比例将含0.3-1m盐酸胍的提取粗产物加入等温扩增反应体系中，此时扩增体系中盐酸胍的浓度为24-80mm，相较于不含盐酸胍的体系，核酸扩增速度显著提高，其中，使用含0.5m盐酸胍提取试剂提取得到的上清液在体系中的加速作用最好。在相同的裂解时间下，随着裂解液中盐酸胍浓度升高，更高浓度的盐酸胍(3m以上)甚至抑制了后续的扩增反应。因此，本专利技术提供的工作浓度不仅保留了盐酸胍快速裂解细胞、释放核酸的优点，还加速了核酸扩增检测，能大大提升核酸扩增现场检测的进度。
6、3-5m尿素：具有较强的蛋白质变性能力，并且能破坏蛋白质内部的氢键和疏水作用力，有利于蛋白质的裂解。这一作用可以抑制dnase的活性，减少dna的降解，且能减少缠绕在dna上的蛋白。尿素在本专利技术提取试剂中的第二个作用是避免盐酸胍的水解。盐酸胍在水溶液中不稳定，会水解为氨和尿素，在提取试剂中加入尿素，可以抑制盐酸胍的水解，提高提取试剂的稳定性，延长保存时间。
7、0.08-0.12m tris-hcl(ph＝8.0±0.5)：提供缓冲环境，防止核酸被破坏；使乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)处于高ph环境，螯合更多的金属离子。
8、0.03-0.07m edta-2na：螯合剂，能与金属离子形成稳定的络合物。在ph值较高(ph＞7)时，可以螯合多种金属离子，抑制dnase的活性，减少dna的降解。
9、进一步的，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.5m，尿素4m，tris-hcl 0.1m，乙二胺四乙酸二钠0.05m，余量为水。
10、本专利技术提供了所述的植物基因组dna快速提取试剂在植物基因组dna提取中的应用。
11、所述应用包括：首先将待测植物组织样本研磨后加入所述的植物基因组dna快速提取试剂进行裂解，然后收集上清液，分离获得植物基因组dna。
12、所述植物组织样本可以为但不限于植物叶片。与果实、根茎等部位相比，叶片中dna含量高、样本获取更为容易、不易损伤植株、更易研磨。
13、本专利技术还提供了所述的植物基因组dna快速提取试剂在快速检测植物靶标dna片段中的应用。
14、所述应用包括：首先将待测植物叶片研磨后加入所述的植物基因组dna快速提取试剂进行裂解，收集上清液；再将上清液加入到环介导等温扩增反应体系中，所述反应体系中含有特异性扩增所述靶标dna片段的引物；然后将反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；最后对反应产物进行分析。
15、本专利技术中，植物样本经所述植物基因组dna快速提取试剂粗提取后可直接进行扩增反应，经测试，裂解得到的上清液中的蛋白等杂质不影响后续的扩增检测。
16、进一步的，环介导等温扩增反应体系中盐酸胍的浓度为24-80mm。在该浓度条件下，对核酸扩增反应均有加速作用。
17、更进一步的，环介导等温扩增反应体系中盐酸胍的浓度为40mm左右。
18、本专利技术还提供了一种转基因作物的快速检测方法，包括以下步骤：
19、(1)取待测转基因作物的叶片，充分研磨后加入所述的植物基因组dna快速提取试剂进行裂解，或者在研磨前加入所述的植物基因组dna快速提取试剂，再边研磨边裂解，得到裂解液，静置后收集上清液；
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【技术保护点】
1.一种植物基因组DNA快速提取试剂，其特征在于，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.3-1M，尿素3-5M，Tris-HCl 0.08-0.12M，乙二胺四乙酸二钠0.03-0.07M，余量为水。
2.如权利要求1所述的植物基因组DNA快速提取试剂，其特征在于，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.5M，尿素4M，Tris-HCl 0.1M，乙二胺四乙酸二钠0.05M，余量为水。
3.如权利要求1或2所述的植物基因组DNA快速提取试剂在植物基因组DNA提取中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：首先将待测植物组织样本研磨后加入所述的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，然后收集上清液，分离获得植物基因组DNA。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物组织样本为叶片。
6.如权利要求1或2所述的植物基因组DNA快速提取试剂在快速检测植物靶标DNA片段中的应用，其特征在于，包括：首先将待测植物叶片研磨后加入所述的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，收集上清液；再将上清液加入到环介导等温扩增反
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，环介导等温扩增反应体系中盐酸胍的浓度为24-80mM。
8.一种转基因作物的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的转基因作物的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，取5-30mg叶片进行研磨，添加100μL的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，裂解时间为3-5min。
10.如权利要求8所述的转基因作物的快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，等温扩增反应条件为65℃下反应30-40min。
...【技术特征摘要】
1.一种植物基因组dna快速提取试剂，其特征在于，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.3-1m，尿素3-5m，tris-hcl 0.08-0.12m，乙二胺四乙酸二钠0.03-0.07m，余量为水。
2.如权利要求1所述的植物基因组dna快速提取试剂，其特征在于，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.5m，尿素4m，tris-hcl 0.1m，乙二胺四乙酸二钠0.05m，余量为水。
3.如权利要求1或2所述的植物基因组dna快速提取试剂在植物基因组dna提取中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：首先将待测植物组织样本研磨后加入所述的植物基因组dna快速提取试剂进行裂解，然后收集上清液，分离获得植物基因组dna。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物组织样本为叶片。
6.如权利要求1或2所述的植物基因组dna快速提取试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，朱媛媛，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：
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