【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地说，是含有gip/glp-1双激动剂多肽(以下简称tzpaa)编码基因重组质粒的乳酸菌，即tzpaa编码基因导入乳酸菌中并表达相应的蛋白，以及其在治疗糖尿病中的应用。
技术介绍
1、gip、glp-1均为肠道分泌的激素，能够促进胰岛素的分泌。tirzepatide(tzp)是通过剪切将这2种肠促胰岛素的作用整合至1个具有39个氨基酸线性肽的单分子中。基于gip的氨基酸序列，位于2位和13位的丙氨酸(ala)用氨基异丁酸(aib)替代，可以防止被dpp4生理降解和失活，提高半衰期。tzp可以同时结合并激活gip和glp-1受体，并且与2种受体结合均具有极高的亲和力。根据这一基本作用机制，tzp在gip和glp-1受体表达的组织和器官，均可起到一定的生理学作用。总而言之，tzp是1个分子作用于2个受体、多个靶器官，产生综合作用，从而起到降血糖和减重的效果。探索tzp治疗t2dm患者的surpass系列研究发现，首先，tzp具有明显的降糖效果，对t2dm患者hba1c的降低最高可达2.3％，除胰岛素之外，在现有的降糖药物中，这一数据是相当可观的。此外，tzp减重效果亦非常明显，患者体重较基线下降11.6％。相信在未来，诸如tzp的双受体激动剂有望解决糖尿病患者的根本性问题和结局性问题，这类药物将会为糖尿病患者的治疗带来非常重要的改变。
2、然而，目前tzp主要由化学合成所得，且只能采用注射给药的方式，导致患者依从性差，同时价格极其昂贵。因此，开发新的gip/glp-1双激动剂多肽的生产方法和给药方
3、乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)广泛存在于自然界，是人和动物正常菌群的主要成员，因其重要的生理功能和公认的安全性，被广泛应用于医药和食品工业中。乳酸菌是肠道益生菌，具有非常多生理功能，如抗肿瘤活性、控制肠内感染、促进小肠局部体液免疫和细胞免疫等。乳酸菌可以在胃肠道、泌尿、生殖系统或黏膜部位粘附存活，且不存在病原性，因此可以将其开发成为蛋白多肽类药物的给药载体，其应用前景十分广阔。
4、但是关于含有gip/glp-1双激动剂多肽编码基因的乳酸菌及其应用目前还未见报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于，提供一种表达gip/glp-1双激动剂多肽的重组载体、表达gip/glp-1双激动剂多肽的食品级乳酸菌表达系统及其制备方法，以及作为肠道益生菌在制备糖尿病口服用药中的应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：首先在pnz8148质粒基础上，分别构建了包含tzpaa基因的诱导型重组表达质粒和组成型重组表达质粒，通过电转化乳酸菌nz9000，表达tzpaa，构建食品级基因工程菌；最后检测该菌在细胞水平上的降糖效果和细胞防护效果。
3、本专利技术的第一方面，提供包含gip/glp-1双激动剂多肽(以下简称tzpaa)编码基因的重组质粒，所述的tzpaa编码基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
4、tacgctgaaggtactttcacttcagattactcaatcgctcttgataaaatcgctcaaaaagctttcgttcaatggcttatcgctggtggtccatcatcaggtgctccaccaccatca(seq id no：1)
5、进一步地，所述的质粒为原核表达质粒。最优选为pnz8148质粒。
6、更进一步地，所述的重组质粒为重组tzpaa诱导型表达质粒或重组tzpaa组成型表达质粒。
7、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的重组tzpaa诱导型表达质粒为pnz8148-pnisausp45-tzpaa-his，所述的重组tzpaa组成型表达质粒为pnz8148-ppepnusp45-tzpaa-his。
8、本专利技术的第二方面，提供包含gip/glp-1双激动剂多肽(tzpaa)编码基因的重组乳酸菌。
9、进一步地，所述的重组乳酸菌包含如上所述的重组质粒。
10、进一步地，所述的乳酸菌选自乳酸乳球菌、植物乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或发酵乳杆菌中的一种。
11、更进一步地，所述的乳酸菌为乳酸乳球菌。
12、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的乳酸菌为乳酸乳球菌l.lactisnz9000。
13、本专利技术的第三方面，提供一种诱导gip/glp-1双激动剂多肽(tzpaa)表达的方法，包括以下步骤：
14、1)以如上所述的包含tzpaa诱导型表达质粒的重组乳酸菌接种培养，加入nisin进行诱导表达；
15、2)收集重组tzpaa。
16、本专利技术的第四方面，提供一种组成型表达gip/glp-1双激动剂多肽(tzpaa)的方法，包括以下步骤：
17、1)以如上所述的包含tzpaa组成型表达质粒的重组乳酸菌接种培养；
18、2)收集重组tzpaa。
19、本专利技术的第五方面，提供如上所述的重组质粒在制备糖尿病治疗药物中的应用。
20、本专利技术的第六方面，提供如上所述的重组乳酸菌在制备糖尿病治疗药物中的应用。
21、进一步地，所述的药物为口服药物。
22、更进一步地，所述的药物中包含如上所述的重组乳酸菌，所述的重组乳酸菌作为肠道益生菌口服给药。
23、本专利技术提供了新的gip/glp-1双激动剂多肽的给药方式，即使用如上所述的重组乳酸菌口服给药。
24、本专利技术的优点和有益效果在于：
25、1、本专利技术利用乳酸菌作为肠道益生菌的优势，制备了表达gip/glp-1双激动剂多肽的重组乳酸菌，开发出了新的、有效的、成本低的gip/glp-1双激动剂多肽的给药剂型或给药途径。
26、2、本专利技术的重组乳酸菌表达的gip/glp-1双激动剂多肽可以有效保护stz诱导的ins-1细胞损伤实验，同时可以促进ins-1细胞分泌胰岛素。因此有望作为肠道益生菌用于糖尿病的口服用药。
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1.包含TZPAA编码基因的重组质粒，所述的TZPAA编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒为重组TZPAA诱导型表达质粒或重组TZPAA组成型表达质粒。
3.包含TZPAA编码基因的重组乳酸菌，所述的TZPAA编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
4.根据权利要求3所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述的乳酸菌选自乳酸乳球菌、植物乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或发酵乳杆菌中的一种。
5.一种诱导TZPAA表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.一种组成型表达TZPAA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求1所述的重组质粒、如权利要求3所述的重组乳酸菌、如权利要求3所述的重组乳酸菌的表达产物重组TZPAA蛋白在制备糖尿病治疗药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物为口服药物。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于
...【技术特征摘要】
1.包含tzpaa编码基因的重组质粒，所述的tzpaa编码基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒为重组tzpaa诱导型表达质粒或重组tzpaa组成型表达质粒。
3.包含tzpaa编码基因的重组乳酸菌，所述的tzpaa编码基因的核苷酸序列如seq idno：1所示。
4.根据权利要求3所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述的乳酸菌选自乳酸乳球菌、植物乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或发酵乳杆菌中...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆斌，王彦婷，郑骄阳，王旭昉，姚春萌，曹岩，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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