【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体、构建方法及其应用。
技术介绍
1、肺癌已经成为致死率最高的一种恶性肿瘤。虽然目前针对肺癌的治疗手段取得了令人瞩目的进展，但是肺癌患者5年生存率仍低于20％。降低肺癌的发病率和病死率已成为我国乃至全球的重大公共卫生问题。肺癌的发生发展与机体的免疫功能密切相关。在肺癌发展过程中，肿瘤诱导产生的免疫抑制性细胞，能够帮助肿瘤逃避机体的免疫攻击，促进肿瘤的发展进程。髓源抑制性细胞(mdscs)作为一群来源于骨髓具有免疫抑制功能的异质性细胞，其在肿瘤免疫逃逸中的作用备受关注。
2、mdscs主要由未成熟的粒细胞(80％)与异常活化的单核细胞(20％)组成，其在肺癌小鼠模型及患者体内大量聚集。小鼠体内，mdscs表型为cd11b+gr1+，并可进一步分为粒细胞样mdscs和单核细胞样mdscs；人类mdscs表型为cd11b+cd33+cd34+hla-dr-/lo。在肺癌发生发展过程中，mdscs作为一群具有免疫抑制功能的细胞，主要通过产生免疫抑制分子如精氨酸酶-1(arg-1)、诱导性一氧化氮合酶(inos)和活性氧(ros)抑制t细胞介导的抗肿瘤免疫应答。通过有效手段调控mdscs的发育以及功能，能够显著提高抗瘤免疫治疗的疗效。目前针对mdscs的抗肿瘤免疫治疗策略主要包括：(1)促进mdscs成熟；(2)抑制mdscs增殖/免疫抑制功能；(3)药物清除mdscs。
3、在人类基因组中存在四种hox基因：hoxa、hoxb、hoxc与
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体、构建方法及其应用，采用本方法得到的表达载体转染至肺癌来源mdscs，验证hoxa1基因在转染后肺癌来源mdscs中的表达，为深入研究hoxa1基因对肺癌来源mdscs功能的调控作用奠定基础。
2、为达成上述目的，本专利技术提出如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术公开一种pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体，所述真核表达载体包含hoxa1基因和氨苄青霉素筛选标签；具体为，以含氨苄青霉素筛选标签的pcdna3.1(+)质粒为载体，在pcdna3.1(+)质粒的限制性酶切位点bamhi和ecori之间插入hoxa1基因，获得所述真核表达载体。
4、第二方面，本专利技术公开上述的pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体的构建方法，具体包括如下步骤：
5、1)以体外获得的人hoxa1基因全长为模板，使用高保真酶进行pcr扩增，获得目的基因；
6、2)采用限制性核酸内切酶bamhi、ecori对pcdna3.1(+)质粒进行双酶切处理，提取酶切片段；
7、3)将目的基因与双酶切处理后的pcdna3.1(+)质粒进行重组克隆，获得包含hoxa1基因的pcdna3.1(+)-hoxa1重组质粒；
8、4)将pcdna3.1(+)-hoxa1重组质粒转化感受态细胞，菌落pcr筛选阳性克隆，抽提pcdna3.1(+)-hoxa1重组质粒；
9、5)对抽提的pcdna3.1(+)-hoxa1重组质粒进行dna测序分析，选取双向测序模式，使用pcdna3.1(+)质粒通用引物横跨质粒的多克隆位点区逐个碱基检测，检测结果与hoxa1基因序列进行比对。
10、进一步的，所述步骤1)中使用高保真酶进行pcr扩增的过程为：
11、根据hoxa1基因的基因序列设计pcr引物，包括上游引物hoxa1-p1和下游引物hoxa1-p2；其中，所述上游引物hoxa1-p1的序列为：
12、5’-cttggtaccgagctcggatccatcatttttcttctccggcccca-3’，
13、所述下游引物hoxa1-p2的序列为：
14、5’-tgctggatatctgcagaattcttttggcttttgaagggagttctgt t-3’；
15、构建pcr反应体系，所述pcr反应体系包括：ddh2o 32μl，10×pcr缓冲液5μl，浓度为2.5mm的dntp mix 5μl，浓度为25mm的mgso4 3μl，浓度为10μm的上游引物hoxa1-p1 1.5μl，浓度为10μm的下游引物hoxa1-p21.5μl，浓度为10ng/μl的模板1μl，浓度为1u/μl的kod-plus-neo 1μl；pcr扩增条件为：98℃10s，60℃30s，68℃180s，进行30个循环。
16、进一步的，所述根据hoxa1基因的基因序列设计pcr引物的原理为：
17、在所述上游引物hoxa1-p1和下游引物hoxa1-p2的序列5’端分别引入同源重组序列扩增目的基因片段，并使得上游引物hoxa1-p1序列的扩增产物、下游引物hoxa1-p2序列的扩增产物分别与其不线性化克隆载体两末端序列完全一致。
18、进一步的，所述步骤4)菌落pcr筛选阳性克隆的扩增体系如下：包括ddh2o9.2μl，2×taq plus master mix 10μl，浓度为10μm的上游引物cmv-f0.4μl，浓度为10μm的下游引物bgh-r0.4μl，单菌落；菌落pcr扩增条件为：94℃30s，57℃30s，72℃180s，进行25个循环；
19、其中，所述上游引物cmv-f序列为：5’-cgcaaatgggcggtaggcg tg-3’；所述下游引物bgh-r序列为：5’-tagaaggcacagtcgagg-3’。
20、第三方面，本专利技术公开上述的pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体在调控肺癌来源mdscs功能中的应用。
21、进一步的，所述应用包括如下步骤：
22、1)获取肺癌患者肿瘤组织的细胞悬液；
23、2)采用流式细胞术，分选人cd33+cd11b+hla-dr-mdscs；
24、3)将pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体转染至人cd33+cd11b+hla-dr-mdscs；
25、4)检测人cd33+cd11b+hla-dr-mdscs中效应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体包含HOXA1基因和氨苄青霉素筛选标签；具体为，以含氨苄青霉素筛选标签的pcDNA3.1(+)质粒为载体，在pcDNA3.1(+)质粒的限制性酶切位点BamHI和EcoRI之间插入HOXA1基因，获得所述真核表达载体。
2.根据权利要求1所述的pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中使用高保真酶进行PCR扩增的过程为：
4.根据权利要求3所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述根据HOXA1基因的基因序列设计PCR引物的原理为：
5.根据权利要求2所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤4)菌落PCR筛选阳性克隆的扩增体系如下：包括ddH2O9.2μL，2×Taq Plus MasterMix 10μL，浓度为10μM的上
6.根据权利要求1所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体在调控肺癌来源MDSCs功能中的应用。
7.根据权利要求6所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体在调控肺癌来源MDSCs功能中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求1所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体在肺癌治疗药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体包含hoxa1基因和氨苄青霉素筛选标签；具体为，以含氨苄青霉素筛选标签的pcdna3.1(+)质粒为载体，在pcdna3.1(+)质粒的限制性酶切位点bamhi和ecori之间插入hoxa1基因，获得所述真核表达载体。
2.根据权利要求1所述的pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中使用高保真酶进行pcr扩增的过程为：
4.根据权利要求3所述pcdna3.1(+)-hoxa1真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述根据hoxa1基因的基因序列设计pcr引物的原理为：
5.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：田新宇，郑齐锶，沈瀚，宁明哲，陶月，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：
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