【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
专利
本专利技术涉及核酸生产，特别是体外rna转录的领域。更具体地说，本专利技术涉及在体外转录期间减少双链rna形成，更特别地通过在rna转录过程期间使用特定量的mg来减少双链rna形成的方法。本专利技术还涉及可通过根据本专利技术的方法获得的体外转录的rna组合物。专利技术背景体外转录(ivt)的一个突出用途是产生用于生物制药和治疗应用的mrna。该方法的简单性，即在体外合成类似于内源性mrna并编码目的蛋白的mrna，然后在体外或体内递送和表达其，使得该方法具有吸引力和广泛的适用性。用于(大规模)合成ivt rna的技术是稳健的和成熟的。一个重要的缺点是体外合成过程中存在或产生引发细胞免疫应答的某些副产物，包括双链rna(dsrna)。将ivt rna用作治疗剂的应用需要大量具有低免疫原性的功能性rna。因此，当合成用于寻求最小化细胞免疫应答的体内应用的mrna时，从mrna制品中消除这些dsrna污染物或减少dsrna形成是至关重要的。已经描述了几种依赖于在ivt反应完成后除去副产物的方法，其中分析纯化诸如基于色谱的纯化方法是最主要的方法。尽管这种方法是高效的，但其导致了mrna合成工作流程中的额外步骤，涉及专门的仪器，通常与反应的加大规模不兼容，可能降低rna产率并妨碍该方法的成本效益。合成后纯化的另一种方法是通过改变ivt反应条件来防止ivt反应中dsrna副产物的形成。已经建议降低ivt反应中的镁水平来减少一些特定模板的dsrna副产物(由反义rna的合成形成)的形成(mu等人2018)；然而，降低反应中的镁浓度也会影响rna的总产率，
技术介绍
技术实现思路
1、在第一方面，本专利技术提供了在体外转录(ivt)反应期间减少双链rna(dsrna)形成的方法，其包括在至少约35mm镁存在的情况下进行所述ivt反应。
2、在另外的实施方案中，在焦磷酸酶存在的情况下进行所述ivt反应。
3、在另一个实施方案中，通过添加金属螯合剂诸如edta来终止所述ivt转录反应。
4、在本专利技术的具体实施方案中，镁的浓度约为35mm以及介于35mm与约150mm之间，优选约为40mm以及介于40mm与约100mm之间，更优选约为45mm以及介于45mm与约75mm之间，最优选约为55mm。
5、在本专利技术方法的另一个具体实施方案中，焦磷酸酶的浓度约为0.01u/ml以及介于0.01u/ml与约40u/ml之间，优选约为0.1u/ml以及介于0.1u/ml与约20u/ml之间，更优选约为1u/ml以及介于1u/ml与约10u/ml之间，最优选约为5u/ml。
6、在另一个具体实施方案中，所述金属螯合剂的浓度约为10mm以及介于10mm与约50mm之间，优选约为20mm以及介于20mm与约30mm之间，更优选约为24mm。
7、在又一另外的实施方案中，镁可呈任何盐的形式，包括氯化镁(mgcl2)、乙酸镁(mgoac2)。
8、在特定实施方案中，所述体外转录反应中的rna还可包含以下各项的一种或多种：5'帽、一种或多种经修饰的核苷和/或poly(a)尾。
9、在另外的方面，本专利技术提供了至少约35mm镁在ivt反应中用于减少所述ivt反应期间双链rna(dsrna)的形成的用途。
10、附图简述
11、现在具体地参考附图，要强调的是，所示的细节是示例性的，并且仅用于说明性论述本专利技术的不同实施方案的目的。它们是为了提供被认为是对本专利技术的原理和概念方面最有用和最容易的描述而提出的。在这方面，除了对本专利技术的基本理解所必需的之外，没有试图更详细地示出本专利技术的结构细节。结合附图的描述使本领域技术人员清楚可以如何在实践中实施本专利技术的几种形式。
12、图1：未加帽的rna(图a)和有cleancap(cap-1)的rna(图b)在24mm对比55mm的镁的浓度下的体外转录后检测到的dsrna的量。
13、与使用24mm mg的反应相比，使用55mm mg使dsrna的量平均减少了62％(图a和图b的平均值)。条纹柱代表24mm的mg浓度，而实心柱代表55mm的mg浓度。相同的样品彼此相邻排列，但用不同量的mg处理(分别为24mm mg对比55mm mg)。所有五种测试的mrna都有不同的开放阅读框，并共享长度为120个核苷酸的统一的polya尾。
14、图2：在用24mm和55mm mg处理的体外转录反应后，利用样品的抗dsrna j2抗体进行的免疫印迹的显影带强度。
15、箭头表示相同的但用不同量的mg(分别为24mm mg对比55mm mg)处理的样品。
16、图3：未加帽的rna(图a)和有cleancap(cap1)的rna(图b)在24mm镁对比55mm镁的浓度下的体外转录反应产率(μg)。
17、条纹柱代表24mm mg浓度，而实心柱代表55mg浓度。相同的样品彼此相邻排列，但用不同量的mg处理(分别为24mm mg对比55mm mg)。
18、专利技术详述
19、现在将进一步描述本专利技术。在下面的段落中，更详细地定义了本专利技术的不同方面。除非明确指出相反的情况，否则可将如此定义的每个方面可以与任何其它方面组合。特别地，可将被指示为优选的或有利的任何特性与被指示为优选的或有利的任何其它特性组合。
20、如在说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。举例来说，“一种(a)化合物”是指一种化合物或不止一种化合物。
21、当涉及可测量值诸如参数、量、持续时间等时，本文所用的术语“约”或“大约”意指包括指本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在体外转录反应期间减少双链RNA(dsRNA)形成的方法，其包括在至少约35mM镁存在的情况下进行所述体外转录反应。
2.根据权利要求1的方法，其中在焦磷酸酶存在的情况下进行所述体外转录反应。
3.根据权利要求1至2中任一项的方法，其中通过添加金属螯合剂诸如EDTA来终止所述体外转录反应。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述镁的浓度约为35mM以及介于35mM与约150mM之间，优选约为40mM以及介于40mM与约100mM之间，更优选约为45mM以及介于45mM与约75mM之间，最优选约为55mM。
5.根据权利要求2至4中任一项的方法，其中所述焦磷酸酶的浓度约为0.01U/ml以及介于0.01U/ml与约40U/ml之间，优选约为0.1U/ml以及介于0.1U/ml与约20U/ml之间，更优选约为1U/ml以及介于1U/ml与约10U/ml之间，最优选约为5U/ml。
6.根据权利要求3至5中任一项的方法，其中所述金属螯合剂的浓度约为10mM以及介于10mM与约50mM之间，优选约为20mM以及介
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中镁以选自包括以下物质的组的形式存在：氯化镁(MgCl2)、乙酸镁(MgOAc2)。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述体外转录反应中的所述RNA还包含以下各项的一种或多种：5'帽、一个或多个经修饰的核苷和/或poly(A)尾。
9.至少约35mM镁在IVT反应中用于在所述IVT反应期间减少双链RNA(dsRNA)的形成的用途。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种在体外转录反应期间减少双链rna(dsrna)形成的方法，其包括在至少约35mm镁存在的情况下进行所述体外转录反应。
2.根据权利要求1的方法，其中在焦磷酸酶存在的情况下进行所述体外转录反应。
3.根据权利要求1至2中任一项的方法，其中通过添加金属螯合剂诸如edta来终止所述体外转录反应。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述镁的浓度约为35mm以及介于35mm与约150mm之间，优选约为40mm以及介于40mm与约100mm之间，更优选约为45mm以及介于45mm与约75mm之间，最优选约为55mm。
5.根据权利要求2至4中任一项的方法，其中所述焦磷酸酶的浓度约为0.01u/ml以及介于0.01u/ml与约40u/ml之间，优选约为0.1u/ml以及介于...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·查利斯，L·鲍尔，
申请(专利权)人：伊泽阿恩埃免疫疗法股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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