RNA纯化方法技术

本发明专利技术总体上涉及RNA纯化方法领域。具体地，本发明专利技术涉及一种用于降低RNA样品中dsRNA含量并且因此增加该样品中ssRNA浓度的方法。所述方法基于在不存在纤维素的条件下对含有ssRNA、dsRNA和至少一种盐的RNA样品进行的过滤步骤。滤步骤。滤步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA纯化方法
专利

[0001]本专利技术总体上涉及RNA纯化方法领域。具体地，本专利技术涉及将ssRNA与dsRNA分离的一种方法；以减少RNA样品中的dsRNA含量并且因此增加所述样品中的ssRNA的浓度，反之亦然。所述方法基于对含有ssRNA、dsRNA和至少一种盐的RNA样品进行的过滤步骤。
[0002]专利技术背景
[0003]体外转录产生的RNA由两个不同的亚群组成：单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)。根据设想的应用，纯化这些亚群中的一个是有利的，例如对于RNA干扰，dsRNA是有利的；而对于治疗用途，ssRNA可以是优选的，因为dsRNA具有固有的免疫原性，因此体外转录的RNA应在治疗用途前耗尽dsRNA。
[0004]文献中先前描述过，单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)可以使用可变浓度的氯化锂选择性沉淀(Voloudakis等，2015)。此外，已经描述过可以使用纤维素层析法分离ssRNA和dsRNA，其中dsRNA与纤维素材料结合，并且允许ssRNA流过(EP3445850A1，等，2019)。然而，这些技术很难扩大到工业批量规模。
[0005]然而，需要进一步的RNA纯化方法，所述方法产生超纯RNA级分，其中dsRNA或备选的ssRNA的剩余级分尽可能低，并且该方法可以扩大到工业批量规模。
[0006]作为这种新型纯化方法开发的一部分，开发了一种基于切向流过滤(TFF)的方法，旨在对产物中间体进行浓缩和渗滤。尽管治疗上有用的mRNA通常具有几百千道尔顿的摩尔质量，但令人惊讶地发现，当使用标称截止值低至30kD的过滤器时，会发生显著的产物损失。本专利技术人的进一步研究表明，这一观察是由于RNA的二级结构大部分是线性的，从而解释了为什么高分子量分子能够迁移通过低分子量截止滤膜。基于这些观察结果，本专利技术人相应地开发了一种使用过滤步骤分离dsRNA和ssRNA的方法，所述方法包括dsRNA和ssRNA具有不同二级结构并因此在使用的过滤器方面表现不同的情况。

技术实现思路

[0007]在第一方面，本专利技术涉及将ssRNA与dsRNA分离的方法；所述方法包含以下步骤：
[0008]a)提供包含至少一种盐、ssRNA和dsRNA的样品；
[0009]b)将步骤a)的所述样品应用于过滤器，从而将所述ssRNA与所述dsRNA分离。
[0010]在一个进一步的实施方案中，所述盐包含离子，所述离子选自包含单价阳离子、三价阳离子、单价阴离子、二价阴离子、三价阴离子或其组合的列表。
[0011]在另一个进一步的实施方案中，所述盐选自包含钠盐、钾盐、锂盐或铵盐的列表，特别是NaCl、LiCl、NH4Cl、KCl、Na3PO4或Na2SO4。
[0012]所述盐可以例如以大约5mM至2M的浓度存在；例如大约5mM至1M，大约5mM至500mM；或者大约15mM至2M；例如大约100mM至1M。
[0013]在本专利技术的另一特定实施方案中，所述样品可以进一步包含至少一种醇，所述醇可以例如选自包含乙醇、异丙醇、丙醇的列表。所述醇可以例如以大约10％
‑
30％(v/v)的浓度存在。
[0014]在另一个具体的实施方案中，所述过滤器具有大约30kD至300kD的孔径。
[0015]在另一个进一步的实施方案中，所述样品进一步包含Tris
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HCl和/或EDTA。
[0016]在一个非常具体的实施方案中，所述样品包含大约10mM之间的EDTA，大约100mM之间的所述盐，并且具有约7.8的pH。
[0017]在本专利技术方法的另一个进一步的实施方案中，步骤b)可以使用选自切向流过滤、渗滤、死端过滤或其组合的方法来实施。
[0018]在一个进一步的实施方案中，所述方法不包括基于纤维素的层析步骤和/或基于纤维素的过滤器。
[0019]在一个进一步的方面，本专利技术还提供了过滤步骤在从样品中分离dsRNA和ssRNA中的用途。
[0020]在一个进一步的方面，本专利技术提供通过本文所定义的方法获得的ssRNA或dsRNA分子，以及其在人类医学和/或兽医学中的用途。
附图说明
[0021]现在具体参考附图，应强调，所示的细节仅作为示例，并且仅用于本专利技术不同实施方案的说明性讨论的目的。它们是为了提供被认为是本专利技术的原理和概念方面的最有用和最容易描述的内容而提出的。在这方面，不试图比基本理解本专利技术所必需的更详细地展示本专利技术的结构细节。结合附图进行的描述使本领域技术人员清楚本专利技术的几种形式如何在实践中体现。
[0022]图1：使用50kD过滤器在1M LiCl或STE+16％乙醇(v/v)中纯化的RNA样品的相对dsRNA含量。
[0023]图2：使用50kD过滤器在STE+16％乙醇(v/v)或STE+24％乙醇(v/v)中纯化的RNA样品的相对dsRNA含量。
[0024]图3：使用100kD过滤器进行死端过滤或使用100kD过滤器进行无渗滤的TFF在STE+16％EtOH中纯化的样品的相对dsRNA含量。
[0025]图4：使用100kD过滤器进行TFF在STE中纯化的样品的相对dsRNA含量。
[0026]图5：显示了在适当的盐缓冲液中超滤和使用TFF将缓冲液交换至WFI后RNA的相对dsRNA含量(5000ng/样品)的狭缝杂交。dsRNA标准品：25ng/ml(A1，H6)、12.5ng/ml(B1，G6)、6.25ng/ml(C1，F6)、3.13ng/ml(D1，E6)、1.56ng/ml(E1，F6)，0.78ng/ml(F1，C6)、0.39ng/ml(G1，B6)、WFI(H1，A6)。用盐缓冲液超滤(UF)接着进行TFF后的RNA样品：STE(A2，A4)、Hold(B2，B4)、ATE(C2，C4)、KTE(E2，E4)、LTE(F2，F4)、Hold(G2，G4)、Na3PO4TE(H2，H4)、Na2SO4(A5，A7)。
[0027]图6：纯化过程前后总RNA的相对dsRNA含量，所述纯化过程由使用不同盐缓冲液进行超滤然后将缓冲液交换至WFI组成。
[0028]图7：不同跨膜压力(TMP)条件下超滤后dsRNA含量。
[0029]图8：在不同剪切速率条件下超滤后dsRNA含量。
[0030]图9：使用不同浓度的盐超滤后dsRNA含量。
[0031]图10：使用具有不同孔径的过滤器超滤后dsRNA含量。
[0032]专利技术的具体实施方式
[0033]现在将进一步描述本专利技术。在以下段落中，更详细地定义了本专利技术的不同方面。除非明确表示相反，否则如此定义的每个方面可以与任何其他方面或多个方面相结合。特别地，说明为优选的或有利的任何特征可以与说明为优选的或有利的任何其他一个或多个特征组合。
[0034]当涉及例如参数、量、时距等可测量值时，本文中使用的术语“大约”或“大致本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种将ssRNA与dsRNA分离的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含至少一种盐、ssRNA和dsRNA的样品；b)将步骤a)的所述样品应用于过滤器，从而在不存在纤维素的条件下将所述ssRNA与所述dsRNA分离。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐包含离子，所述离子选自包含单价阳离子、三价阳离子、单价阴离子、二价阴离子、三价阴离子或其组合的列表。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述盐选自包含钠盐、钾盐、锂盐或铵盐的列表，例如选自NaCl、LiCl、NH4Cl、KCl、Na3PO4或Na2SO4。4.根据权利要求1
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3所述的方法，其中所述样品进一步包含至少一种醇。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述醇选自包含乙醇、丙醇或异丙醇的列表。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中步骤b)使用选自切向流过滤、渗滤、死端过滤或其组合的方法进行。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述样品包含大约5mM至2M的盐浓度；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：伊泽阿恩埃免疫疗法股份有限公司，
类型：发明
国别省市：