【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含rna组合物的领域，更具体地说，涉及用于冷冻储存的含体外转录的mrna的组合物的稳定化。具体而言，本专利技术提供了用于减少或避免在此类含rna的组合物(即使是冷冻并随后解冻的)中形成聚集体/沉淀物的解决方案。此外，本专利技术提供了通过在冷冻所述组合物之前向所述组合物中添加金属结合螯合剂来防止在冷冻或解冻的含rna的组合物中形成聚集体/沉淀物的手段和方法。
技术介绍
0、技术背景
1、含mrna/rna组合物的体内应用领域的主要挑战之一是rna的稳定性。从本质上来说，与单链相比双链dna是稳定得多的，其柔性更大得多并可形成弱的内部键。此外，rna在核糖的第二个碳上有羟基，这增加了糖-磷酸骨架断裂的可能性。另外，rna对由内源性核糖核酸酶产生的降解非常敏感，然而，在冷冻rna样品时，内源性核糖核酸酶会迅速失活。因此，通常冷冻rna以长期保存。
2、尽管体外转录的rna可直接用于进一步加工或纯化，但有时首先冷冻rna(诸如在另一个设施中进行进一步加工的情况下)可以是有利的；或者用于累积较大的批次以供进一步处理。然而，在体外转录后但在进一步加工前冷冻rna的这种情况下，本申请的专利技术人鉴定了特定mrna分子的低温贮存导致其在解冻样品后聚集。显然，解冻后mrna分子的聚集是非常不想要的，特别是在仍然需要进一步加工/纯化的情况下。例如，当样品进行后续的柱纯化步骤时，沉淀被认为是体外转录的mrna损失的主要原因。因此，本专利技术的目的是提供该问题的解决方案。
3、在含有cap-1结构的体外
4、本专利技术的专利技术人出乎意料地发现，金属离子，特别是二价金属离子诸如mg2+是mrna_ivt混合物在低于0℃的温度下储存后解冻后的沉淀过程中涉及的组分之一。加入金属结合螯合剂如edta以隔离金属离子诸如mg2+有效地解决了含有cap-1结构的mrna分子中的沉淀问题。本专利技术人表明沉淀在至少三种情况下发生：首先，含有cap-1结构的mrna样品显示沉淀。第二，沉淀仅发生在储存温度低于0℃后解冻的样品中。第三，沉淀发生在含有金属离子诸如mg2+阳离子的样品中。
5、因此，本专利技术提供了用于减少或避免在此类含rna的组合物(即使是冷冻并随后解冻的)中形成聚集体/沉淀物的解决方案。在ivt反应结束时，金属结合螯合剂诸如edta的存在至少有三个主要好处。除了(i)保持rna的电荷和构象均一性和(ii)防止在某些条件下形成聚集体之外，金属结合螯合剂的存在还(iii)防止rna降解，因为作为核酸酶的金属依赖性酶会失活。在需要长期储存mrna_ivt混合物的情况下，edta防止聚集和rna降解的能力可能起到至关重要的作用。
技术实现思路
0、专利技术概要
1、在第一方面，本专利技术涉及减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的方法，所述组合物包含具有5′cap-1结构的体外转录的mrna；所述方法包括：在冷冻所述组合物之前，向所述组合物中加入金属结合螯合剂。
2、在本专利技术的具体实施方案中，所述组合物还包含二价金属离子。
3、在本专利技术的另一个具体实施方案中，所述金属结合螯合剂能够结合二价金属离子。
4、在特定的实施方案中，所述二价金属离子选自包括以下的列表：ca2+离子、cu2+离子、fe2+离子、zn2+离子和mg2+离子；优选地mg2+离子。
5、在又一另外的特定实施方案中，在所述组合物中以等摩尔浓度(mol dm-3)或高于所述二价金属离子的浓度的浓度使用所述金属结合螯合剂。
6、在本专利技术的具体实施方案中，所述金属结合螯合剂选自包括以下的列表：bapta(1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′-四乙酸)、dfoa(甲磺酸去铁胺)、二甲氧基硝基苯胺(1-(2-硝基-4,5-二甲氧基苯基)-1,2-二氨基乙烷-n,n,n′,n′-四乙酸)、edta(乙二胺四乙酸)、edta钙钠、edta四钠、egta(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-n,n,n′,n′-四乙酸)、cdta(1,2-环己二胺四乙酸)、dpta(二乙烯三胺五乙酸)、pih(吡哆醛异烟酰腙)、tpen(n′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)。
7、在本专利技术的特定实施方案中，所述冷冻或解冻的组合物将在或已经在-20℃或更低的温度下冷冻。
8、在另一个特定实施方案中，所述解冻的组合物将在或已经在约20℃与30℃之间解冻。
9、在另一方面，本专利技术还提供了金属结合螯合剂用于减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的用途，所述组合物包含具有cap-1结构的体外转录的mrna分子。
10、专利技术详述
11、如上文已经详述的，本专利技术涉及用于冷冻储存的体外转录的含mrna组合物的稳定化。特别地，其涉及避免或减少冷冻样品中的沉淀，从而在后续纯化诸如柱沉淀后显著增加mrna的产量。特别地，在ivt(体外转录)之后，在进一步加工之前，诸如在不同的位置/设施进行进一步加工时，将获得的mrna组合物储存特定的一段时间可能是有益的。然而，由于mrna的性质，这种储存优选在-20℃或更低的降低的温度下进行。本专利技术人已经发现，尽管在降低的温度下储存ivt mrna混合物，仍导致了聚集体/沉淀物的形成，这对于进一步的加工显然是不希望的。为此，本专利技术人已经建立了确定此类沉淀物形成的原因的研究计划，以及避免/减少此类沉淀物的解决方案。其细节可在下文的实施例部分找到。
12、基于这些观察，本专利技术的第一方面涉及减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的方法，所述组合物包含具有5′cap-1结构的体外转录mrna；所述方法包括：在冷冻所述组合物之前，向所述组合物中加入金属结合螯合剂。
13、在本专利技术的说明书中，术语“减少(reduc ing)”或可替代地“降低(to reduce)”意指“变少(lessen)”、“减少(decrease)”、“最小化(minimize)”或“削减(diminish)”所述样品中聚集的形成。因此，当样品在正常情况下冷冻后含有特定量的聚集体时，术语“减少”意指当将所述样品经受本专利技术的方法时，所述聚集体的量较低。特别地，当与未经处理的样品相比时，聚集体的量优选减少至少10％，诸如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％。
14、在本专利技术的说明书中，术语“防止”或可替代地“阻止”意指完全(即100％)或至少显著地“停止”、“避免”、“阻止”、“阻断”或“停止”所述样品中聚集的形成。其中与未经处理的样品相比，显著地意指至少为95％，诸如至少为96％，至少为97％，至少为98％，至少为99％。
15、聚集体的量可以通过目测检查样品来确定，或者可选地使用合适的技术通过实验来确定。例如，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的方法，所述组合物包含具有5′CAP-1结构的体外转录的mRNA；所述方法包括：在冷冻所述组合物之前，向所述组合物中加入金属结合螯合剂。
2.根据权利要求1所述的方法；其中所述组合物还包含二价金属离子。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述金属结合螯合剂能够结合二价金属离子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述二价金属离子选自包括以下的列表：Ca2+离子、Cu2+离子、Fe2+离子、Zn2+离子和Mg2+离子；优选地Mg2+离子。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法；其中在所述组合物中以等摩尔浓度(moldm-3)或高于所述二价金属离子的等摩尔浓度的浓度使用所述金属结合螯合剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述金属结合螯合剂选自包含以下各项的列表：BAPTA(1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸)、DFOA(甲磺酸去铁胺)、二甲氧基硝基苯胺(1-(2-硝基-4,5-二甲氧基苯基)-1,2-二氨基乙烷-N
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述冷冻或解冻的组合物将在或已经在-20℃或更低温度下冷冻。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述解冻的组合物将在或已经在约20℃与30℃之间解冻。
9.金属结合螯合剂用于减少和/或防止包含具有CAP-1结构的体外转录的mRNA分子的冷冻或解冻的组合物中聚集形成的用途。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的方法，所述组合物包含具有5′cap-1结构的体外转录的mrna；所述方法包括：在冷冻所述组合物之前，向所述组合物中加入金属结合螯合剂。
2.根据权利要求1所述的方法；其中所述组合物还包含二价金属离子。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述金属结合螯合剂能够结合二价金属离子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述二价金属离子选自包括以下的列表：ca2+离子、cu2+离子、fe2+离子、zn2+离子和mg2+离子；优选地mg2+离子。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法；其中在所述组合物中以等摩尔浓度(moldm-3)或高于所述二价金属离子的等摩尔浓度的浓度使用所述金属结合螯合剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述金属结合螯合剂选自包含以下各项的列表：bapta(1...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·查利斯，L·鲍尔，
申请(专利权)人：伊泽阿恩埃免疫疗法股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。