检测RNAm6A修饰引起的免疫反应的方法技术

检测RNA m6A修饰引起的免疫反应的方法。本发明专利技术属于分子生物学领域，提供了一种体外检测含有N6

【技术实现步骤摘要】
检测RNA m6A修饰引起的免疫反应的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种m6A甲基化修饰对RNA引起的细胞免疫反应的检测方法.

技术介绍

[0002]RNA的转录后修饰对RNA功能的正常发挥至关重要.目前已在RNA上鉴定出超过100种不同类型的修饰，其中N6
‑
甲基腺苷酸修饰(N6
‑
methyladenosine，m6A)是哺乳动物mRNA上含量最为丰富的一种修饰类型。
[0003]m6A的修饰位点高度保守，通常富集在3
’‑
非翻译区(3
’‑
UTR)、近终止密码子处的 RRACH(R＝G/A；H＝A/C/U)基序上.在哺乳动物中，m6A修饰受到甲基转移酶、去甲基化酶以及m6A识别蛋白等多种因子的调控.m6A通过对RNA降解、翻译和剪接等分子过程的调控来参与许多细胞生物学过程，如免疫调节、脂肪代谢、生物节律、生殖发育等.除此之外，m6A及其调控因子参与了免疫识别、先天及适应性免疫反应激活以及细胞命运的决定，在免疫系统相关基因表达的严格调控过程中发挥了重要作用.
[0004]越来越多的研究发现在病毒和原核生物的RNA上也存在大量的m6A修饰，然而目前的技术无法帮助我们去准确的解释这些修饰存在的意义.近年来，随着m6A检测技术的不断发展，人们实现了从ELISA简单定量到单碱基分辨率RNA测序技术的突破，这帮助我们可以在单碱基水平上实现对RNA修饰的调控.然而，目前基于体外合成获得的转录本受限于RNA结构和性质的不稳定性，往往面临着易降解、修饰难度大、无法获得天然结构以及成本高等问题.因此，我们提供了一种基于免疫沉淀来获取天然含有与不含有m6A修饰的RNA分子，并由此来模拟RNA诱导的免疫过程的方法.此方法可以帮助我们在体外快速准确的判断m6A修饰对RNA免疫反应性的影响，有助于对m6A修饰生物学意义的探索.

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种体外检测m6A修饰对RNA免疫原性影响的方法.
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于免疫沉淀来获得存在与不存在m6A修饰的天然RNA的方法，包括以下步骤：
[0007](1)细胞或组织样本中的总RNA的提取；
[0008](2)取上述获得的总RNA与m6A特异性抗体在IP缓冲液中4℃孵育过夜；
[0009](3)向上述混合液中加入免疫磁珠，4℃孵育2
‑
3h后回收上清.
[0010](4)用IP缓冲液将(3)中磁珠洗涤3次，然后加入洗脱液来洗脱磁珠上的RNA.
[0011](5)将(3)和(4)步骤获得的上清以及洗脱液进行乙醇沉淀，分别在上清和洗脱液中获得存在与不存在m6A修饰的天然RNA.
[0012]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(1)中的样本选择包括但不限于临床、动物组织样本，真核、原核细胞，病毒，体液，外泌体等.
[0013]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(2)中RNA投入量要保证在20
‑
25ug.
[0014]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(2)中的m6A抗体可以特异性区分含有与不含有m6A修饰的RNA，并将含有m6A修饰的RNA富集下来.
[0015]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(3)中的上清被认为含有不存在m6A修饰的 RNA.
[0016]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(4)中的洗脱液被主为含有存在m6A修饰的 RNA.
[0017]前述的方法，步骤(5)之后使用Nanodrop2000超微量分光光度计完成对RNA的浓度以及质量的测定.
[0018]前述的方法，步骤(5)之后使用m6A定量试剂盒检测(3)和(4)步骤中获得的RNA的 m6A甲基化水平，以yeast tRNA为阴性对照，total RNA为空白对照.
[0019]第二方面，本专利技术提供一种外源性RNA免疫原性的检测方法，包括：
[0020](1)将免疫沉淀获得的含有与不含有m6A修饰外源RNA转染进细胞中；
[0021](2)Trizol提取转染细胞的总RNA；
[0022](3)将上述RNA进行反转录获得cDNA，通过qPCR的方法来检测相关免疫因子的表达情况.
[0023]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(1)使用Lipo3000实现对任意的人类或其他哺乳动物细胞系的外源RNA的转染.
[0024]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(1)以原核生物中提取的RNA Gluc作为阳性对照，来检测RNA的转染效率.
[0025]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(2)之后使用Nanodrop2000超微量分光光度计完成对RNA的浓度测定.
[0026]前述的方法，本专利技术特征在于步骤(3)可以通过不同的引物实现对多种免疫因子的mRNA的表达水平的检测.
[0027]基于上述的技术方案，本专利技术包含至少以下优点：
[0028](一)本专利技术所述技术方案操作简便，成本低.本专利技术基于体外免疫沉淀的方法获取天然的含有与不含有m6A修饰的RNA，从根本上避免了体外转录与修饰实验中RNA获取困难、难以体现天然RNA的真实结构、成本高等缺点.
[0029](二)本专利技术所述技术方案特异性高.本专利技术基于高度特异性的m6A抗体来区分含有与不含有m6A修饰的RNA分子，并配有对RNA浓度与质量的检测方法，保证获得的RNA的纯度与特异性.
[0030](三)本专利技术所述技术方案应用范围广.本专利技术可以实现对临床组织样本、动物组织样本、细胞、病毒，体液，外泌体等多种来源的RNA的免疫原性的检测；本专利技术通过RNA转染在多种细胞系中实现对RNA免疫原性的检测.
[0031](四)本专利技术所述技术方案弥补了对病毒和原核生物的RNA上m6A修饰生物学意义的研究.
附图说明
[0032]图1为本专利技术体外获得有无m6A修饰的RNA的方法原理图.
[0033]图2A为本专利技术中SH
‑
SY5Y细胞系m6A
‑
IP上清中RNA的浓度与质检结果.
[0034]图2B为本专利技术中SH
‑
SY5Y细胞系m6A
‑
IP洗脱液中RNA的浓度与质检结果.
[0035]图2C为本专利技术中SH
‑
SY5Y细胞系m6A
‑
IP上清与洗脱液中m6A含量的ELISA检测结果.
[0036]图3A为本专利技术检测m6A修饰对RNA免疫原性影响的方法原理图.
[0037]图3B为本专利技术阳性对照的序列及其转染效果.
[0038]图3C为本专利技术体外转染有无m6A修饰的小鼠细胞系的免疫因子检测结果.
[0039]图3D为本专利技术体外转染有无m6A修饰的人源细胞系的免疫因子检测结果.
具体实施方式
[0040]本专利技术提供了一种体外检测m6A修本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于免疫沉淀来获得存在与不存在m6A修饰的天然RNA的方法，包括以下步骤：(1)细胞或组织样本中的总RNA的提取；(2)取上述获得的总RNA与m6A特异性抗体在IP缓冲液中4℃孵育过夜；(3)向上述混合液中加入免疫磁珠，4℃孵育2
‑
3h后回收上清。(4)用IP缓冲液将(3)中磁珠洗涤3次，然后加入洗脱液来洗脱磁珠上的RNA。(5)将(3)和(4)步骤获得的上清以及洗脱液进行乙醇沉淀，分别在上清和洗脱液中获得存在与不存在m6A修饰的天然RNA。2.外源性RNA免疫原性的检测方法，包括以下步骤：(1)将免疫沉淀获得的含有与不含有m6A修饰外源RNA转染进细胞中；(2)Trizol提取转染细胞的总RNA；(3)将上述RNA进行反转录获得cDNA，通过qPCR的方法来检测相关免疫因子的表达情况。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)m6A抗体可以特...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘文琦，
申请(专利权)人：潘文琦，
类型：发明
国别省市：