本申请涉及对虾黄头病毒的检测技术领域，具体涉及YHV‑1检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用。该引物对与对虾黄头病毒的N基因的特异性序列匹配，特异性序列如SEQ ID NO.1所示。实施例提供的YHV‑1检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用，能够对YHV‑1的特异序列进行快速扩增，使得检测特异性强。扩增产物能够被crRNA或CRISPR组合物靶向切割，切割效率高，切割产物能够极大增强检测的特异性和灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本申请涉及对虾黄头病毒的检测，具体涉及yhv-1检测引物、crrna、crispr组合物、试剂盒及应用。
技术介绍
1、对虾黄头病毒(yellow head virus genotype 1，yhv-1)是导致对虾传染性疾病病原之一，急性感染在2～4天即出现停食等症状，死亡率高，濒死虾头胸部因肝胰腺发黄而变成黄色，故由黄头病毒引起的疾病称为黄头病。我国将其列为二类疫病。
2、oie水生动物疫病诊断手册(oie,2015)认为，在虾生活周期全过程中适用于yhv-1检测、诊断和确诊的分子生物学方法仅有pcr方法(rt-pcr或巢式rt-pcr)与核酸测序，但这两种方法操作复杂繁琐、测序确证周期较长、成本较高，需要昂贵仪器和熟练的操作人员，检测场所也局限于有条件的实验室中，不能满足现场快速检测的需要。
技术实现思路
1、本申请专利技术人通过对yhv-1的n基因的特异性序列研究发现，利用其扩增出目的序列并反转录成rna。构建靶向切割该反转录的rna的crrna、cas酶和报告rna，依次构建crispr反应体系，从而实现对其靶向切割。将其切割产物通过报告rna的信号放大，能够与免疫层析试纸结合，实现可视化检测，从而使得对yhv-1的检测更加方便和准确，检测手段更加便捷。
2、基于此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
3、第一方面，实施例公开了一种引物对。所述引物对与对虾黄头病毒的n基因的特异性序列匹配，特异性序列如seq id no.1所示。
4、在第一方面的一些实施例中，所述引物对具有如seq id no.4～5所示的核苷酸序列。
5、第二方面，实施例公开了一种crrna。所述crrna包括与cas蛋白结合的锚定序列和靶向对虾黄头病毒n基因的特异性序列的向导序列，特异性序列如seq id no.1所示。
6、在第二方面的一些实施例中，所述锚定序列具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。
7、在第二方面的一些实施例中，所述crrna具有如seq id no.3所示的核苷酸序列。
8、在第二方面的一些实施例中，所述crrna还包括位于所述向导序列3’端至少一个pfs识别序列。在一些实施例中，所述pfs识别序列3’端碱基为a，u或c。
9、在第二方面的一些实施例中，所述crrna还具有位于所述锚定序列与所述向导序列之间的间隔序列。在一些实施例中，所述间隔序列由t7启动序列和cas13a靶向crispr的重复区序列(gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaac)构成。
10、第三方面，实施例公开了一种crispr组合物。所述crispr组合物包括cas蛋白、和crrna或二者形成的复合体。所述crrna包括与cas蛋白结合的锚定序列和靶向对虾黄头病毒n基因的特异性序列的向导序列，特异性序列如seq id no.1所示。
11、在第三方的一些实施例中，所述crispr组合物还包括报告rna。所述报告rna的两个末端分别标记生物素和能与所述胶体金标记抗体结合的基团。
12、第四方面，实施例公开了一种试剂盒。所述试剂盒包括免疫层析试纸和crispr组合物。所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有t线和c线的nc膜和吸水滤纸，所述t线由链霉亲和素形成，所述c线由所述胶体金标记抗体的二抗形成。所述crispr组合物包括报告rna、crrna和cas蛋白，所述的crrna，其包括与cas蛋白结合的锚定序列和靶向对虾黄头病毒n基因的特异性序列的向导序列，所述报告rna的两个末端分别标记生物素和能与所述胶体金标记抗体结合的基团，所述cas蛋白为第二类v型或vi型crispr系统中的cas蛋白。
13、在第四方面的一些实施例中，所述试剂盒还包括与对虾黄头病毒的n基因的特异性序列匹配的引物对。在一些实施例中，所述引物对具有如seq id no.4～5所示的核苷酸序列。
14、在第四方面的一些实施例中，所述case蛋白选自lwcas13a蛋白、cas12a或cas12b蛋白中的至少一种。
15、在第四方面的一些实施例中，所述试剂盒还包括用于扩增对虾黄头病毒的n基因的特异性序列的试剂，特异性序列如seq id no.1所示。在一些实施例中，所述扩增为等温扩增raa、变温扩增pcr或等温扩增lamp中的至少一种。在一些实施例中，所述胶体金标记抗体为抗fitc抗体。
16、第五方面，实施例公开了第一方面所述的引物对、第二方面所述的crrna、第三方面所述的crispr组合物或第四方面所述的试剂盒在制备具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：
17、1)检测目标核酸是否为对虾黄头病毒的核酸；
18、2)检测目标核酸是否为对虾黄头病毒n基因的核酸；
19、3)检测目标核酸是否为对虾黄头病毒n基因特异性序列的核酸，特异性序列如seqid no.1所示；
20、4)检测体外样本中是否还有如1)～3)任一所述目标核酸。
21、在一些实施例中，所述体外样本选自血液样本、唾液样本、个体样本、组织样本、汗液样本、尿液样本、咽拭子样本、乳液样本、精液样本、皮肤擦拭样本、粪便样本、痰液样本中的至少一项。例如，对虾个体样本。
22、本申请实施例提供的yhv-1检测引物、crrna、crispr组合物、试剂盒及应用，能够对yhv-1的特异序列进行快速扩增，使得检测特异性强。扩增产物能够被crrna或crispr组合物靶向切割，切割效率高，切割产物能够极大增强检测的特异性和灵敏度。利用报告rna对切割产物进行信号关联和放大，能够实现在免疫层析试纸上的可视化检测，促使检测过程更加便捷，便于推广应用。
本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物对，其与对虾黄头病毒的N基因的特异性序列匹配，所述特异性序列如SEQID NO.1所示。
2.一种crRNA，其包括与Cas蛋白结合的锚定序列和靶向对虾黄头病毒N基因的特异性序列的向导序列，特异性序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的crRNA，可选地，所述锚定序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
4.一种CRISPR组合物，包括Cas蛋白和crRNA，和/或所述Cas蛋白和所述crRNA形成的复合体；
5.根据权利要求4所述的CRISPR组合物，还包括报告RNA，所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和能与所述胶体金标记抗体结合的基团。
6.一种试剂盒，其包括：
7.根据权利要求6所述的试剂盒，还包括与对虾黄头病毒的N基因的特异性序列匹配的引物对。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述引物对具有如SEQ ID NO.4～5所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，可选地，所述case蛋白选自Cas13a蛋白、Cas12a或Cas12b蛋白中的至少一种；
10.如权利要求1所述的引物对、如权利要求2所述的crRNA、如权利要求4所述的CRISPR组合物或如权利要求6～9任一所述的试剂盒在制备具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：
...
【技术特征摘要】
1.一种引物对，其与对虾黄头病毒的n基因的特异性序列匹配，所述特异性序列如seqid no.1所示。
2.一种crrna，其包括与cas蛋白结合的锚定序列和靶向对虾黄头病毒n基因的特异性序列的向导序列，特异性序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求2所述的crrna，可选地，所述锚定序列具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；
4.一种crispr组合物，包括cas蛋白和crrna，和/或所述cas蛋白和所述crrna形成的复合体；
5.根据权利要求4所述的crispr组合物，还包括报告rna，所述报告rna的两个末端分别标记生物素和能与...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐彬，尹伟力，鲁闽，史青，孙洁，刘荭，王津津，
申请(专利权)人：烟台海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。