超人源化抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种将抗体人源化的方法，其基于通过比较非人抗体的可变区的ＣＤＲ序列的规范ＣＤＲ结构类型与人抗体序列文库的相应ＣＤＲ的规范ＣＤＲ结构类型而自人抗体基因中选出可变区构架序列，优选的是胚系抗体基因片段。具有与非人ＣＤＲ相似的规范ＣＤＲ结构类型的人抗体可变区形成了一种成员人抗体序列的亚组，从中可选出人构架序列。通过人与非人ＣＤＲ序列之间的氨基酸相似性可以对亚组成员进一步评级。选择评级靠前的人序列以提供构架序列，用于利用所选定的亚组成员人构架来构建嵌合抗体，该嵌合抗体用非人ＣＤＲ对应物功能性取代了人ＣＤＲ序列，因此提供了具有高亲和力及低免疫原性的人源化抗体，且不需要比较非人与人抗体之间的构架序列。本发明专利技术还公开了根据本发明专利技术方法制备的嵌合抗体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请为于2002年7月12日提交的专利技术名称为“超人源化抗体”的02829598.6号中国专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求于2001年7月12日提交的美国临时申请60/305,111的优先权。政府资助声明本专利技术的研发受到美国国立卫生研究院基金的资助，基金号为CA-18029。
本专利技术涉及将抗体人源化的方法，特别涉及通过生成含有来自非人抗体的CDR序列以及人抗体的构架序列(framework sequences)的嵌合抗体将抗体人源化的方法，更特别涉及选择用于进行人源化的适宜的人抗体构架序列的方法，以及仍更特别涉及用非人抗体的规范CDR结构类型(canonical CDR structure types)与人抗体的胚系的规范CDR结构类型的比较作为选择用于人源化抗体的适宜的人构架序列的基础。
技术介绍
抗体是天然蛋白质，是脊椎动物免疫系统对外来物质(抗原)的反应形式，主要用于对抗感染。一个多世纪以来，已经在人工条件下在动物体内诱导出抗体并收集用于疾病的治疗或诊断，或用于生物学研究。每一个单个的产生抗体的细胞产生在化学上具有明确组成成分的单一类型的抗体，然而，直接从反应于抗原接种的动物血清中获得的抗体事实上包括各不相同的一群产生抗体的细胞所产生的一群不完全一样的分子(也就是，多克隆抗体)。杂交瘤技术提供了繁殖单个产生抗体的细胞无数代的方法以及识别能与特殊抗原相互作用的产生抗体的细胞克隆的筛选方法。本技术的发展容许生成无限量的具有几乎任何所需的抗原特异性的结构完全一致的抗体。这些抗体通常被称作为单克隆抗体，并且绝大多数都来源于啮齿动物。对单克隆抗体基因的测序可以定义抗体的一级氨基酸结构。重组DNA方法学的出现使得可以对抗体基因进行结构改造并产生具有杂交瘤技术所不能获得的特性的经改造的抗体分子。在治疗领域，该方法学的一个目标是通过改造啮齿动物的单克隆抗体的一级氨基酸结构以减少这些抗体在人体内的免疫原性。减弱治疗性抗体的免疫原性是合乎需要的，因为所诱导的免疫反应可引起患者的多种副作用，范围从治疗性抗体被加速清除并因此造成的作用丧失，到最极端的致死性过敏反应。减弱外源性单克隆抗体的免疫原性的一个策略是用人源的类似功能区取代单克隆抗体的轻链和重链恒定区，只留下完整的外源性抗体的可变区。轻链和重链的可变区负责抗体与抗原之间的相互作用。连接可变区与恒定区的铰链区位于远离抗原结合部位的区域，因此可变区与恒定区之间的铰链区通常不干扰抗原结合。小鼠可变区连接到人恒定区的嵌合分子通常与嵌合分子所起源的小鼠抗体以相同的亲和常数与抗原结合。这些嵌合抗体比它们的完全的鼠对应物在人体内具有更少的免疫原性。虽然如此，保留有整个鼠可-->变区的抗体仍在相当一部分患者中引发了免疫反应。例如，INFLIXIMABTM，一种被广泛处方的被认为是安全的嵌合抗体，它在47个克隆病患者的7个患者中诱导了人抗嵌合抗体反应(Rutgeerts，P.，et al(1999)Efficacy and safety of retreatment with anti-tumor necrosis factor antibody(INFLIXIMAB)to maintain remission in Crohn′sdisease.Gastroenterology 117，761-769)。人会发动对整个鼠可变区的免疫反应是在预料之中的，因此甚至在报道这些标准嵌合抗体的临床试验之前已经开始获得具有更多人特征的可变区的尝试。常被称为“人源化”的方法的一个策略旨在通过重组地构建具有鼠与人特征的抗体可变区将鼠单克隆抗体的可变区转变为更多的人的形式。人源化策略依照于对抗体结构数据的一些共识。首先，可变区含有在同一物种内是保守的而在进化遥远的物种之间例如鼠和人之间是不同的肽序列的毗邻束(contiguous tracts)。第二，其它毗邻束在同一物种内是不保守的，而且甚至在同一个体的产生抗体的细胞之间甚至都不同。第三，抗体与抗原的接触主要通过可变区的非保守区域发生。第四，抗体可变区的分子结构在不同物种之间是十分相似的，因此只根据位置而无需试验数据，就可以定义不同物种之间的相应的氨基酸残基的位置。人源化策略的前体是用在人抗体的相应位置上发现的残基取代鼠序列的特征性氨基酸残基将减少所形成的抗体在人体内的免疫原性。然而，不同物种之间的序列取代常造成抗体与抗原的结合能力的下降。因此人源化的技术在于平衡为减少免疫原性而对原始鼠序列的取代与人源化抗体所需的保持治疗有用的足够多的抗原结合性。用两种方法已经达到这种平衡。在一个方法中，如Studnicka的美国专利No.5,869,619以及Padlan (1991)A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand binding properties，Molecular Immunology 28：489-498所例示的，用于特征性取代鼠可变区残基的人残基被认为或被预计是(i)在与抗原的相互作用上不发挥重要的化学作用，以及(ii)定位于延伸到溶剂的侧链上，因此，远离于抗原结合位点的外在残基被人源化，而内在残基、抗原结合残基以及形成可变区之间的接触面的残基仍是鼠的。它的方法的一个缺点是需要相当多的试验数据来确定残基在抗原结合上是否发挥不重要的化学作用或残基在特殊的三维抗体结构上是否位于溶剂中。在一个更常用的方法中，如Winter的美国专利No.5,225,539以及Jones et al(1986)Replacing the complementarity determining regions in ahuman antibody with those from a mouse，Nature 321：522-525所例示的，被认为是保守的鼠可变区肽序列的毗邻束被人抗体的相应的毗邻束所取代。在这个更常用的方法中，除了涉及抗原结合的非保守区域外，所有可变区残基都被人源化。为了确定用于取代的适宜的毗邻束，Winter和Jones等(1986)利用了Wu和Kabat(1970)先前已经开发的抗体可变区序列的分类。Wu和Kabat首创对抗体肽序列的线性排列，并且他们在这方面的贡献是多方面的：首先，通过对可变区之间的序列相似性的研究，他们识别了在所有脊椎动物物种的所有抗体之间是更大或更少程度同源的相应的残基，因为这些残基采用了同样的三维机构、起到了同样的功能作用、与周围残基同样的相互作用以及存在于相同的化学环境中。第二，他们创造了肽序列编号系统，其中同源的免疫球蛋白残基被赋予相同的位置号码。本领域人员不依赖于除外序列本身的其它任何的试验数据就可以明确地指定任何可变区序列的现-->在常被称为Kabat编号的号码。第三，对于每个Kabat编号的序列位置，Kabat和Wu计算变异性，它指的是将可变区序列线性排列时的少数或许多可能的氨基酸的所见。他们识别出隐藏于四个较少变异的毗邻区域内的三个高变异性的毗邻区域。其它研究者先前已经注意到近乎在这些区域(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗体分子，包括：　　重链目标可变区，所述重链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自重链被研究可变区的ＣＤＲ序列，其中所述目标可变区构架的特征在于与所述被研究可变区构架序列具有不超过１０个氨基酸残基的差异，并在相应位置上有两个目标可变区ＣＤＲ与所述被研究可变区ＣＤＲ具有相同的规范结构类型，条件是所述重链目标可变区的ＣＤＲ２的残基６１－６５是来自所述重链被研究可变区的残基６１－６５；和　　轻链目标可变区，所述轻链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自轻链被研究可变区的ＣＤＲ序列，其中所述目标可变区构架的特征在于与所述被研究可变区构架序列具有不超过１０个氨基酸残基的差异，并在相应位置上有两个目标可变区ＣＤＲ与所述被研究可变区ＣＤＲ具有相同的规范结构类型，　　其中所述嵌合抗体分子的ＣＤＲ边界和残基编号是通过Ｋａｂａｔ定义的。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗体分子，包括：重链目标可变区，所述重链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自重链被研究可变区的CDR序列，其中所述目标可变区构架的特征在于与所述被研究可变区构架序列具有不超过10个氨基酸残基的差异，并在相应位置上有两个目标可变区CDR与所述被研究可变区CDR具有相同的规范结构类型，条件是所述重链目标可变区的CDR2的残基61-65是来自所述重链被研究可变区的残基61-65；和轻链目标可变区，所述轻链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自轻链被研究可变区的CDR序列，其中所述目标可变区构架的特征在于与所述被研究可变区构架序列具有不超过10个氨基酸残基的差异，并在相应位置上有两个目标可变区CDR与所述被研究可变区CDR具有相同的规范结构类型，其中所述嵌合抗体分子的CDR边界和残基编号是通过Kabat定义的。2.一种嵌合抗体分子，包括：重链目标可变区，所述重链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自重链被研究可变区的CDR序列，并在相应位置上有两个目标可变区CDR与所述被研究可变区CDR具有相同的规范结构类型，条件是所述重链目标可变区的CDR2的残基61-65可以是来自所述重链被研究可变区的残基61-65，且构架序列的残基27-30可以是来自所述被研究可变区的构架序列的残基27-30；和轻链目标可变区，所述轻链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自轻链被研究可变区的CDR序列，并在相应位置上有两个目标可变区CDR与所述被研究可变区CDR具有相同的规范结构类型，其中所述嵌合抗体分子的CDR边界和残基编号是通过Kabat定义的。3.权利要求2的嵌合抗体分子，其中所述被研究可变区是非人可变区。4.权利要求2的嵌合抗体分子，其中所述非人可变区是小鼠的可变区。5.权利要求3的嵌合抗体分子，其中所述目标可变区是人可变区。6.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述人可变区构架序列选自由Vκ、Vλ、VH、JH、Jκ和Jλ序列所组成的组。7.权利要求5的嵌合抗体分子，其同时包含嵌合可变轻链区和嵌合可变重链区。8.权利要求7的嵌合抗体分子，其中将所述嵌合可变轻链区和嵌合可变重链区装配形成选自Fab片段、(Fab)’2分子和单链Fv分子中的一种分子。9...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰斐逊富特，
申请(专利权)人：杰斐逊富特，
类型：发明
国别省市：US[美国]