【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开内容属于基因治疗领域。更具体地，本公开内容提供了用于表达小型化的人微小抗肌营养不良蛋白(微小抗肌营养不良蛋白)基因的基因治疗载体，例如腺相关病毒(aav)载体，其中所述aav是从在悬浮条件下培养的贴壁细胞中产生的。本公开内容还提供了使用这些载体在骨骼肌(包括膈肌和心肌)中表达微小抗肌营养不良蛋白，以及保护肌纤维免受损伤、增加肌力、减少和/或预防患有肌营养不良的受试者中的纤维化的方法。
技术介绍
1、肌肉质量和力量对日常活动(例如运动和呼吸)以及全身新陈代谢的重要性不言而喻。肌肉功能缺陷会导致肌营养不良(md)，其表征为肌无力和肌萎缩，并严重影响生活质量。最典型的md是由编码抗肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(dapc)的成员的基因的突变所导致。这些md是由与通过dapc束缚的肌膜-细胞骨架的缺失相关的膜脆性所导致的。杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy,dmd)是最具破坏性的肌肉疾病之一，每5,000名新生男婴中就有1人患病。
2、dmd是由dmd基因突变导致mrna减少和抗肌营养不良蛋白...
【技术保护点】
1.一种通过悬浮播种工艺在贴壁哺乳动物细胞中产生重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的方法，包括：
2.权利要求1的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。
3.权利要求2的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。
5.权利要求1至4中任一项的方法，...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种通过悬浮播种工艺在贴壁哺乳动物细胞中产生重组腺相关病毒(raav)raavrh74.mhck7.微小抗肌营养不良蛋白的方法，包括：
2.权利要求1的方法，其中所述raav包含seq id no:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。
3.权利要求2的方法，其中所述raav包含seq id no:7的mhck7启动子序列。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述raav包含seq id no:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和seq id no:7的mhck7启动子序列。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述悬浮播种工艺还包括：
6.权利要求5的方法，其中包含raavrh74.mhck7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒包含：
7.权利要求5或6的方法，其中所述包含aav rep基因和aav cap基因的质粒包含aav2rep基因和raavrh74 cap基因。
8.权利要求5至7中任一项的方法，其中所述腺病毒辅助质粒包含腺病毒5e2a、e4orf6和va rna基因。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述悬浮播种工艺还包括：
10.权利要求9的方法，其中通过冻融、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、去污剂裂解或其组合来裂解所述贴壁细胞。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述悬浮播种工艺还包括：
12.权利要求11的方法，其中所述至少一个柱色谱步骤包括阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱或其组合。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述悬浮播种工艺进一步包括在n-3容器中用所述第一生长培养基培养细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述悬浮播种工艺进一步包括在n-4容器中用所述第一生长培养基培养细胞。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述生物反应器是贴壁生物反应器。
16.权利要求15的方法，其中从在贴壁生物反应器中产生的培养物纯化raav。
17.权利要求15或16的方法，其中生物反应器中的第三培养基包含至少一种促进细胞粘附的因子。
18.权利要求17的方法，其中所述至少一种促进细胞粘附的因子选自血清、fbs、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、钙离子、细胞外基质的蛋白聚糖或非蛋白聚糖多糖和其组合。
19.权利要求17或18的方法，其中所述生物反应器中的第三培养基包含dmem和10％fbs。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中将所述贴壁细胞在悬浮条件下培养约48-72小时。
21.权利要求1至20中任一项的方法，其中所述n-1容器是悬浮摇瓶。
22.权利要求1至21中任一项的方法，其中所述贴壁细胞选自由hela细胞、cho细胞、hek-293细胞、vero细胞、bhk细胞、mdck细胞、mdbk细胞和cos细胞组成的组。
23.权利要求22的方法，其中所述贴壁细胞是hela细胞或hek-293细胞。
24.权利要求23的方法，其中所述贴壁细胞是hek-293细胞。
25.权利要求1至24中任一项的方法，其中所述贴壁细胞不是经悬浮适应的。
26.权利要求1至25中任一项的方法，其中在悬浮条件下培养细胞不改变所述细胞的贴壁依赖性。
27.权利要求1至26中任一项的方法，其中所述培养不改变所述细胞以产生新的细胞系。
28.一种组合物，其包含重组腺相关病毒(raav)raavrh74.mhc...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·阿拉姆，L·罗迪诺克拉帕克，
申请(专利权)人：萨雷普塔治疗公司，
类型：发明
国别省市：
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