【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基于数字pcr定量检测aml grhl2基因甲基化的方法。
技术介绍
1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,aml)是一种高度异质性疾病，病因和发病机制非常复杂。尽管这一领域的研究已经取得了很大的进展，但白血病的病因仍未被完全了解，除了传统分类的m3型之外，其他类型难以彻底治愈。根据流行病学的统计，中国白血病的自然发病率为3/10万-4/10万，并呈增长趋势。全国有400万名白血病患者，每年新增约4万名白血病患者，5年生存率小于33％，aml的进展较为迅速，如果不及时治疗，通常会在数周或数月内致命。
2、目前，临床上主要通过血象、骨髓象和细胞化学染色对aml进行诊断，大多数患者确诊时已经到了中高危的危险等级，病情复杂。越早发现患病和复发的患者越有可能接受根治性治疗，其治疗效果和预后均明显优于晚期aml。因此，aml的早期诊断意义非常重大。血象、骨髓象和细胞化学染色均需病情进展到一定程度才能确诊aml，因此，aml早期诊断困难的原因：其一是缺乏可靠的生物标志物，其二是特异且敏感的检测方法。
3、dna甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在调节基因表达中起着至关重要的作用。dna甲基化是癌症发展过程中的早期事件，将可靠的生物标记物纳入aml筛查项目将有助于早期识别患者。但目前对于aml具有高敏感性及特异性的甲基化基因及基于该基因的检测技术并未见报道。因此，用于aml检测和随访的可重复的表观遗传血液检测尚未成功发展为常规临床测试。利用dna甲基化标记开发可
4、grainyhead-like 2(grhl2)基因与多种癌症的发生、进展和生存率低下有关，其在不同肿瘤中发挥的作用不同。一些研究报道grhl2在胃癌、宫颈癌、肾透明细胞癌和肉瘤中具有抑癌作用，另一些研究表明grhl2是一种癌基因，它可以增强结直肠癌中癌细胞的增殖，且其在结直肠癌中的表达水平与甲基化呈负相关。有研究发现grhl2在aml中的表达是降低的，本专利技术也发现其在aml中甲基化表达增高，因此grhl2基因甲基化检测可以作为aml风险预测及临床诊断分子标志物，还可作为aml新型药物研发的靶点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对现有技术的不足而提供一种用于诊断aml的甲基化标志物，且提供了一种基于数字pcr平台定量检测该基因的数字pcr引物探针组合物及其检测体系，所述甲基化标志物为grhl2。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：用于检测grhl2基因甲基化的特异性引物和探针组合，所述引物包含上游引物f和下游引物r，上游引物f的序列如seq id no:1所示，下游引物r的序列如seq id no:2所示；所述探针包含探针p1和探针p2，探针p1的序列如seq id no:3所示，探针p2的序列如seq id no:4所示。
3、进一步的，所述探针p1在5’端采用hex报告基团，3’端采用mgb淬灭基团，其结合甲基化序列；探针p2在5’端采用fam报告基团，3’端采用mgb淬灭基团，其结合非甲基化序列。
4、一种适于数字pcr定量检测aml的grhl2基因甲基化的试剂盒，包括权利要求1所述的引物探针组合。
5、进一步的，所述试剂盒还包括dna提取试剂、重亚硫酸盐修饰试剂和数字pcr反应液。
6、一种基于数字pcr平台定量检测aml的grhl2基因甲基化的检测方法，包括如下步骤：
7、步骤一：样本准备：从全血样本中提取全血基因组dna；
8、步骤二：dna修饰：重亚硫酸盐处理步骤一获得的基因组dna，使dna中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变,得到转化后的dna；
9、步骤三：配制反应液：将步骤2所得到的dna模板、上游引物f和下游引物r、探针p1、探针p2、2×dpcr promix(cy5.5)和无核酸酶水进行混合，制备得到dpcr反应体系；
10、步骤四：液滴数字pcr：
11、(1)将配制好的反应液放入pcr仪中，按照设置好的反应程序，使用dpcr反应体系进行dpcr反应；
12、(2)收集dpcr的荧光信号，分析实验数据进行结果定量计算。
13、进一步的，步骤三所述的反应液体系为：步骤二获得的dna模板4ul、上下游引物各0.2ul、探针p1和探针p2各0.05ul、2×dpcr promix(cy5.5)11ul,无核酸酶水6.5ul,共22ul。
14、进一步的，步骤四所述反应程序为：液滴平铺:60℃,5min，1个循环；预变性：95℃，5min，1个循环；变性：95℃，30s；退火/延伸：55℃，60s，共进行45个循环。
15、进一步的，所述dpcr反应体系中，所述上游引物f和下游引物r终浓度均为900nm；所述探针p1和探针p2的终浓度均为250nm。
16、所述试剂盒在定量检测aml grhl2基因甲基化上的应用。
17、根据dpcr的荧光信号进行结果判断：若hex通道有阳性液滴，则样本中存在甲基化；若fam通道有阳性液滴，则样本中存在非甲基化；若hex通道和fam通道均有阳性液滴，则样本中甲基化和非甲基化均存在。
18、根据dpcr的荧光信号及各通道的靶标浓度进行数据分析定量计算：
19、1.若仅hex通道存在阳性液滴，则样本中仅有甲基化存在，grhl2基因甲基化的浓度＝hex靶标浓度，甲基化率为1；
20、2.若仅fam通道存在阳性液滴，则样本中仅有非甲基化存在，grhl2基因非甲基化的浓度＝fam靶标浓度，甲基化率为0；
21、3.若hex通道和fam通道均存在阳性液滴，则样本中既有甲基化又有非甲基化存在，grhl2基因甲基化的浓度＝hex靶标浓度，grhl2基因非甲基化的浓度＝fam靶标浓度，甲基化率为hex靶标浓度/(fam靶标浓度+hex靶标浓度)。
22、微滴生成是dpcr的关键步骤，只有微滴数大于等于15000时，样本质控才合格，系统才能对阳性和阴性微滴进行计数。
23、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
24、1.本专利技术采用taqman-mgb探针检测结合微滴式数字pcr检测的手段，对grhl2基因甲基化位点精确检测，绝对定量、特异性高、准确性高以及灵敏度高，检测方便快捷、结果准确可靠，能够用于aml早期的筛查。
25、2.本专利技术提供的检测方法，所需仪器为核酸提取仪、反转录仪和数字pcr仪，通过提取全血基因组dna，并进行重亚硫酸盐转化，再配制dpcr反应液，将反应液置于数字pcr仪后进行液滴生成、pcr扩增和数据采集分析，操作简便、高效快捷地完成了grhl2基因的定量检测。
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1.用于检测GRHL2基因甲基化的特异性引物和探针组合，其特征在于：所述引物包含上游引物F和下游引物R，上游引物F的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物R的序列如SEQ IDNO:2所示；所述探针包含探针P1和探针P2，探针P1的序列如SEQ ID NO:3所示，探针P2的序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测GRHL2基因甲基化的特异性引物和探针组合，其特征在于：所述探针P1在5’端采用HEX报告基团，3’端采用MGB淬灭基团，其结合甲基化序列；探针P2在5’端采用FAM报告基团，3’端采用MGB淬灭基团，其结合非甲基化序列。
3.一种适于数字PCR定量检测AML的GRHL2基因甲基化的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.一种适于数字PCR定量检测AML的GRHL2基因甲基化的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA提取试剂、重亚硫酸盐修饰试剂和数字PCR反应液。
5.一种基于数字PCR平台定量检测AML的GRHL2基因甲基化的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.用于检测grhl2基因甲基化的特异性引物和探针组合，其特征在于：所述引物包含上游引物f和下游引物r，上游引物f的序列如seq id no:1所示，下游引物r的序列如seq idno:2所示；所述探针包含探针p1和探针p2，探针p1的序列如seq id no:3所示，探针p2的序列如seq id no:4所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测grhl2基因甲基化的特异性引物和探针组合，其特征在于：所述探针p1在5’端采用hex报告基团，3’端采用mgb淬灭基团，其结合甲基化序列；探针p2在5’端采用fam报告基团，3’端采用mgb淬灭基团，其结合非甲基化序列。
3.一种适于数字pcr定量检测aml的grhl2基因甲基化的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.一种适于数字pcr定量检测aml的grhl2基因甲基化的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括dna提取试剂、重亚硫酸盐修饰试剂和数字pcr反应液。
5.一种基于数字pcr平台定量检测aml的grhl2基因甲基化的检...
【专利技术属性】
技术研发人员：褚苗苗，付波，化静，王丙发，
申请(专利权)人：聊城市人民医院，
类型：发明
国别省市：
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