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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子生物学领域,具体说是一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna及其防治方法。
技术介绍
1、milrna介导的跨界调控在植物与病原体相互作用中起着重要作用。真菌milrna已被证明通过调节大丽花轮枝菌、稻瘟病菌和苹果腐烂病中的致病基因以参与植物侵染过程。然而,植物病原真菌的milrnas介导的跨界调控的功能和机制在很大程度上仍是未知的。苹果早期落叶病是苹果目前感染的较为严重的真菌性病害,包括苹果斑点落叶病(alternaria sp.mali,alt1)、苹果褐斑病(marssonina leaf spot,mls1)及苹果炭疽叶枯病(glomerella leaf spot,gls1)。苹果早期落叶病侵染苹果叶片后,会使苹果在生长早期发生落叶的现象,对苹果的产量形成巨大的影响,因此,探究苹果早期落叶病的致病机制及防治方法十分必要。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的缺陷,本专利技术的目的在于提供一种苹果早期落叶病菌跨界传递的milrna及其防治方法。本专利技术通过比较苹果接种苹果斑点落叶病alternariasp.mali(alt1)前后milrna的表达差异,得到了一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna,命名为altmilr823。研究发现,与未接种alt1、gls1(glomerella leaf spot)与mls1(marssonina leaf spot)的gl-3相比,在接种了alt1、gls1与mls1后的gl-3中altmilr823的表
2、为达到以上目的,本专利技术采取的技术方案是:
3、一种苹果早期落叶病菌跨界传递的milrna(命名为altmilr823),其特征在于,其核苷酸序列如seq id no:1所示。
4、一种苹果早期落叶病菌跨界传递的milrna的初级转录本(命名为altmilr823),其特征在于,其核苷酸序列如seq id no:2所示。
5、一种检测苹果早期落叶病菌跨界传递milrna的原位杂交方法,其特征在于,包括如下步骤:
6、s1:取接菌48h后叶片和未接菌叶片,先分别在rnase浸泡15min,然后用ph 7.4的1×pbs洗涤3次;将处理后的叶片样品放置于4%多聚甲醛真空浸润15min,至样品下沉,变成半透明状,然后放到4℃冰箱过夜;
7、s2:所有样品用1×pbs冲洗3次,每次间隔5min。冲洗后的样品在添加20μg/ml蛋白酶k和0.5%triton-x的te缓冲液中37℃处理2-3h,以消化细胞内多余的rna酶和蛋白质,并渗透细胞以进入探针;
8、s3:经s2处理的样品在ph 7.4的1x pbs中冲洗3次,每次冲洗间隔5分钟;在室温下用0.2%甘氨酸浸泡5分钟,以终止蛋白酶活性;经甘氨酸处理后,样品用4%多聚甲醛固定5分钟,再次在1x pbs缓冲液中冲洗;
9、s4:将lna和fam修饰后的探针用50%甲酰胺中85℃变性3min,然后立即冰浴5min;
10、s5:将经s4处理的20μl浓度为35μm的探针溶液和作为无探针对照的20μl的50%甲酰胺溶液,分别连同80μl的杂交缓冲液加入到装有经s3处理的样品管中,50℃,300rpm过夜孵育;
11、s6:将0.2×ssc缓冲液加入经s5处理的样品管中,50℃,300rpm清洗30min,上述清洗重复一次;
12、s7:将包含0.1%碘化丙啶的0.2×ssc缓冲液加入经s6处理的样品管中,37℃,300rpm清洗5min;
13、s8:将包含0.1%碘化丙啶的0.2×ssc缓冲液加入经s7处理的样品管中,室温,300rpm清洗5min;
14、s9:用0.2×ssc缓冲液漂洗经s8处理的样品,去色。
15、在上述方案的基础上,所述的经lna和fam修饰后的探针的序列如seq id no:3所示。
16、一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna的靶基因(命名为mdpecl4),其特征在于,其核苷酸序列如seq id no:4所示。
17、一种植物表达载体,其特征在于,所述植物表达载体为包含检测早期落叶病菌跨界传递的milrna的pfgc5941载体。
18、一种工程菌,其特征在于,包含上述植物表达载体(该植物表达载体为包含检测早期落叶病菌跨界传递的milrna的pfgc5941载体)。
19、一种植物表达载体,其特征在于,包含上述靶基因的pfgc5941载体。
20、一种工程菌,其特征在于,包含上述的植物表达载体(该植物表达载体为包含上述靶基因的pfgc5941载体)。
21、一种提高苹果植株对苹果早期落叶病菌抗性的方法,其特征在于,包括如下步骤:
22、s1:通过ctab方法提取感病苹果总rna;
23、s2:将经s1提取的总rna逆转录成cdna;
24、s3:利用s2得到的逆转录的模板和rt-pcr引物克隆权利要求5所述的靶基因;
25、s4:将s3得到的靶基因插入pfgc5941载体上的bamhi和ncoi两个酶切位点中,转入大肠杆菌dh5α中;
26、s5:提取经s4构建的过表达靶基因载体质粒;
27、s6:将s5提取的质粒转入农杆菌中,涂布于加有抗生素的固体yep培养基上,将平板置于28℃恒温培养箱中倒置培养24-48h;上述抗生素包含50mg/l kana,20mg/l rif;
28、s7:从经s6培养的农杆菌菌板挑取单斑,加入到2ml包含50mg/lkana,20mg/l rif的yep液体培养基中,28℃,180rpm培养过夜;
29、s8:取80μl经s7培养的农杆菌菌液,加入到4ml包含50mg/lkana,20mg/l rif及10μm乙酰丁香酮的yep液体培养基中,28℃,180rpm培养12-16h;
30、s9:将经s8培养的农杆菌菌液室温10000rpm离心1min,除去培养基;用1-2ml悬浊液经涡旋震荡悬浮上述菌液;取经震荡悬浮的菌液10μl加入990μl悬浊液得菌体悬浊液,用分光光度计测定其od600,将菌体悬浊液调整至od600=1.0,室温静置2-5h;上述悬浊液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苹果早期落叶病菌跨界传递milRNA,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述一种苹果早期落叶病菌跨界传递milRNA的初级转录本,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种检测苹果早期落叶病菌跨界传递milRNA的原位杂交方法,其特征在于,包括如下步骤:
4.如权利要求3所述的一种检测苹果早期落叶病菌跨界传递milRNA的原位杂交方法,其特征在于,所述的经LNA和FAM修饰后的探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
5.一种植物表达载体,其特征在于,所述植物表达载体为包含权利要求1所述一种检测早期落叶病菌跨界传递milRNA的pFGC5941载体。
6.一种工程菌,其特征在于,包含权利要求5所述的植物表达载体。
7.一种苹果早期落叶病菌跨界传递milRNA的靶基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
8.一种植物表达载体,其特征在于,包含权利要求7所述靶基因pFGC5941载体。
9.一种工程菌,其
10.一种提高苹果植株对苹果早期落叶病抗性的方法,其特征在于,包括如下步骤:
...【技术特征摘要】
1.一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna,其特征在于,其核苷酸序列如seq id no:1所示。
2.如权利要求1所述一种苹果早期落叶病菌跨界传递milrna的初级转录本,其特征在于,其核苷酸序列如seq id no:2所示。
3.一种检测苹果早期落叶病菌跨界传递milrna的原位杂交方法,其特征在于,包括如下步骤:
4.如权利要求3所述的一种检测苹果早期落叶病菌跨界传递milrna的原位杂交方法,其特征在于,所述的经lna和fam修饰后的探针的序列如seq id no:3所示。
5.一种植物表达载体,其特...
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