【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种ω-转氨酶突变体及其编码基因与应用。
技术介绍
1、手性胺是许多生物活性化合物、农用化学品和精细化学品的手性砌块。在过去的几十年里，可持续地、有效的手性胺合成方法取得了重大的进展，包括传统的金属催化化学还原反应，以及由亚胺还原酶/胺脱氢酶、转氨酶、单胺氧化酶和裂解酶等催化的酶促方法。生物催化法在生产手性胺产品的化学合成中具有吸引力，因为其中温和的反应条件，避免使用潜在污染的金属催化剂和较低的环境影响。转氨酶介导的不对称还原胺化反应，具有高立体选择性和最大理论产率100％等优点，是一种应用广泛的手性胺合成方法。ω-转氨酶(ω-ta，ec 2.6.1.x)是一种磷酸吡哆醛(plp)依赖酶，催化氨基供体(通常为丙氨酸或异丙胺(ipa))氨基可逆转移到前手性酮，酮酸，或醛生成相应的手性氨基化合物。ω-tas通常属于plp依赖酶超家族中的折叠i型和折叠iv型亚家族。ω-折叠i型(iii类转氨酶)的tas催化的底物具有多样性，但立体特异性只有(s)-选择性。(r)-ω-tas存在于折叠iv型亚家族(iv类转氨酶)，其中还包括支链氨基酸转氨酶(bcat)和d-氨基酸转氨酶(daat)。(r)-ω-tas因其不对称合成(r)-胺而受到研究者的关注，因此折叠iv型plp依赖的酶是挖掘(r)-tas的关键来源。
2、ω-tas的活性形式一般是同源二聚体，活性口袋由两个单体的残基组成，位于二聚体的界面上，形成一个大口袋和一个小口袋。转氨反应遵循乒乓双双反应机制，催化中心是高度保守的赖氨酸。ω-tas严格
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种ω-转氨酶突变体及其编码基因，并应用于微生物催化前西他列汀酮不对称合成西他列汀中间体中，以克服现有技术中自然界中存在的(r)-转氨酶稀少、难以催化长侧链底物等问题。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、第一方面，本专利技术提供了一种ω-转氨酶突变体，将如seq id no.3所示的氨基酸序列的第290位，第292位，第163位，第130位，第144位，第142位，第101位和第140位进行单位点突变或者定点半饱和突变后获得。
4、本专利技术提供了一种具有(r)-立体选择性的ω-转氨酶突变体，获得该ω-转氨酶突变体的筛选和改造策略包括：首先以已知的严格r选择性(r)-ω-转氨酶(pdb：5fr9)为探针，在ncbi数据库中筛选序列相似性高且三维结构模型符合折叠类型iv的plp依赖型转氨酶，以前西他列汀酮的截断(羰基侧链的短链为一个甲基)类似物为底物，催化表征数据库挖掘的ω-转氨酶，获得潜在的能够催化前西他列汀酮的候选ω-转氨酶mwta，所述ω-转氨酶mwta源自mycolicibacterium wolinskyi，其氨基酸序列如seq id no.1所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。通过与严格的(r)-ω-转氨酶(pdb：5fr9，其氨基酸序列如seq id no.7所示)序列比对后，确定5fr9的(r)-选择性控制的2个关键序列motif，通过片段替换技术，将如seq id no.1所示氨基酸序列第69位至81位(记为motif1，36bp)和第130位至148位(记为motif2，48bp)与(r)-转氨酶5fr9对应片段进行motif替换后获得嵌合体mwtamc，该mwtamc嵌合体的氨基酸序列如seq id no.3所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，该mwtamc嵌合体首次对底物前西他列汀酮具有催化活性，且表现出严格的(r)-选择性。
5、为提高酶活，第一步将所述mwtamc嵌合体工程菌e.coli bl21(de3)/pet28b(+)-mwtamc活化并提取质粒pet28b(+)-mwtamc，并保存于-20℃。第二步通过swiss-model进行同源建模，获得嵌合体mwtamc的三维结构；然后再通过hotspot wizard预测嵌合体mwtamc的活性中心和相关的氨基酸；再通过同源模型与底物的分子对接，考察底物范围内的氨基酸。分析二种方法获得的氨基酸，确定重叠的氨基酸为突变热点，发现影响酶活的关键氨基酸位点。以pet28b(+)-mwtamc为模板质粒，通过对以上位点进行单位点突变或者定点饱和突变，获得突变质粒，并转化，获得一系列突变体，即将如seq id no.3所示的氨基酸序列的第290位，第292位，第163位，第130位，第144位，第142位，第101位和第140位进行单位点突变或者定点半饱和突变后获得的所述ω-转氨酶突变体。
6、作为优选，所述ω-转氨酶突变体是将如seq id no.3所示的氨基酸序列进行下列之一或其中两种以上的组合突变后获得：(1)第290位苏氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，将如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第290位，第292位，第163位，第130位，第144位，第142位，第101位和第140位进行单位点突变或者定点半饱和突变后获得。
2.如权利要求1所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，将如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行下列之一或其中两种以上的组合突变后获得：(1)第290位苏氨酸突变为丝氨酸；(2)第292位丙氨酸突变为甘氨酸；(3)第163位亮氨酸突变为异亮氨酸；(4)第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸；(5)第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸；(6)第142为苏氨酸突变为色氨酸；(7)第101位赖氨酸突变为精氨酸；(8)第130位缬氨酸突变为组氨酸；(9)第140位丝氨酸突变为精氨酸。
3.如权利要求1或2所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.5所示。
4.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.8
5.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸，第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸，第142为苏氨酸突变为色氨酸，第101位赖氨酸突变为精氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
7.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸，第142为苏氨酸突变为色氨酸，第101位赖氨酸突变为精氨酸，第130位缬氨酸突变为组氨酸，第140位丝氨酸突变为精氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
8.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.一种含有编码如权利要求1～8中任意一项所述的ω-转氨酶突变体的基因的重组载体或基因工程菌。
10.权利要求1～8中任意一项所述的ω-转氨酶突变体在微生物催化前西他列汀酮不对称合成西他列汀中间体中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，将如seq id no.3所示的氨基酸序列的第290位，第292位，第163位，第130位，第144位，第142位，第101位和第140位进行单位点突变或者定点半饱和突变后获得。
2.如权利要求1所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，将如seq id no.3所示的氨基酸序列进行下列之一或其中两种以上的组合突变后获得：(1)第290位苏氨酸突变为丝氨酸；(2)第292位丙氨酸突变为甘氨酸；(3)第163位亮氨酸突变为异亮氨酸；(4)第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸；(5)第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸；(6)第142为苏氨酸突变为色氨酸；(7)第101位赖氨酸突变为精氨酸；(8)第130位缬氨酸突变为组氨酸；(9)第140位丝氨酸突变为精氨酸。
3.如权利要求1或2所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq idno.8或seq id no.9或seq id no.10或seq id no.5所示。
4.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq idno.8所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如seq id no.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列如seqid no.7所示。
5.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq idno.9所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如seq id no.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸，...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，朱芳莹，张晓健，黄梦钰，郑垦，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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