【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子标记，具体涉及一种绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记、筛选方法及其应用。
技术介绍
1、肌内脂肪是形成羊肉大理石纹的物质基础。肌内脂肪的含量与羊肉嫩度、多汁性和风味直接相关。研究结果表明，2-3％的肌内脂肪沉积量是良好羊肉品质的一个理想标准，若肌内脂肪含量低于2％，羊肉的质地和口感都会变差，而若肌内脂肪含量高于3％，则对提高羊肉的口感和风味不再有贡献，反而会造成肉食品脂肪含量过高，无法适应消费市场对于低脂肪羊肉的需求。我国很多地方绵羊品种所产的羊肉之所以深受人们的喜爱，原因之一便是其含有丰富的肌内脂肪，肉质鲜嫩、多汁，风味独特。而诸如萨福克、特克赛尔和陶赛特等世界著名瘦肉型绵羊品种所产羊肉，由于肌内脂肪含量过少，造成其羊肉口感不佳。所以，通过现代育种技术适当提高瘦肉型绵羊品种肌内脂肪含量，一直是肉羊育种的重要目标。
2、肌内脂肪细胞由其前体脂肪细胞发育而来，所以骨骼肌中前体脂肪细胞的数量将直接决定肌内脂肪的沉积量，进而对羊肉品质产生重要影响。然而，肌内脂肪在骨骼肌中大量沉积前，其前体脂肪细胞在骨骼肌中的数量极少，且分布非常分散。所以肉羊育种中要准确掌握肌内脂肪沉积规律及沉积量，进而开展精准选育，现有的传统测定技术很难完成。
3、另外，在肉羊性成熟前，其肌内脂肪的沉积一直处于抑制状态，该阶段的肉羊即使饲喂高能量饲料，其肌内脂肪也不会出现明显的沉积，直至性成熟后这一抑制才被逐步解除。所以，使用传统测定技术测定羊肉中肌内脂肪的含量，然后以此进行肉羊选种，必须等肉羊达到性成熟，肌内脂肪大量沉积以
4、所以，本专利技术提供了一种绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记及其应用，以解决上述技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是：本专利技术提供了一种绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记、筛选方法及其应用，有效解决了肉羊肌内脂肪沉积能力无法实现早期、精准评估的技术问题，为肉羊育种提供了便捷的技术手段。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供了一种绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记，所述绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记为ensoarg00000019070基因，所述ensoarg00000019070基因的cdna序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术的有益效果是：本专利技术通过对肉羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记ensoarg00000019070基因表达量的定量分析，对肉羊后期肌内脂肪沉积能力进行准确评估，进而选择肌内脂肪沉积能力强的肉羊个体进行育种，在实现了早期选种的同时大大提高了肉羊肌内脂肪沉积能力这一性状选育的准确性，从而很好地克服了目前常规育种手段无法实现早期、精准选择的技术难题，为肉羊肉质品质的选育提高提供了便捷的技术手段。
5、第二方面，本专利技术还提供了一种用于扩增绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的引物，该引物还包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6、本专利技术上述进一步有益效果是：通过构建正向引物和反向引物能够对ensoarg00000019070基因进行扩增从而对其表达量进行定量分析，进而更准确的对绵羊肌内脂肪的沉积能力进行评估。
7、第三方面，本专利技术还提供了一种绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记在评估绵羊肌内脂肪沉积能力中的应用。
8、本专利技术的有益效果是：通过检测该特异性分子标记ensoarg00000019070基因的表达量，进而确定背最长肌中肌内前体脂肪细胞的含量，以便于更方便和准确地对绵羊肌内脂肪的沉积能力进行评估，进而通过定向育种实现为消费市场提供质量更高的羊肉的目的。
9、第四方面，本专利技术还提供了一种用于评估绵羊肌内脂肪沉积能力的试剂盒，包括上述的用于扩增绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的引物。
10、本专利技术的有益效果是：通过制成试剂盒以便于操作人员更方便的对羊肉内特异性分子标记ensoarg00000019070基因的表达量进行检测，从而提高了对绵羊肌内脂肪的沉积能力的评估效率和准确性，简化了操作步骤。
11、第五方面，本专利技术还提供了一种筛选绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的方法，包括如下步骤：s1、采集公绵羊的右侧12至13对肋骨间背最长肌，记为d360，采集出生当天的公绵羊右侧背最长肌，记为d1；s2、将所述d360和所述d1分别与i型胶原酶混合并初次离心，再分别细胞消化后初次过滤，得到滤液，将所述滤液二次离心后得到消化液和漂浮于所述消化液表面的成熟脂肪细胞，取所述成熟脂肪细胞备用，将所述消化液二次过滤后三次离心，之后弃上清液并重悬，得到沉淀细胞。s3、将来自于所述d360的沉淀细胞和成熟脂肪细胞混合，得到待测序样品i，将来自于所述d1的沉淀细胞和成熟脂肪细胞混合，得到待测序样品ii；s4、对质检合格的所述待测序样品i进行测序并剔除异常细胞和低质量细胞，得到有效细胞i，对质检合格的所述待测序样品ii进行测序并剔除异常细胞和低质量细胞，得到有效细胞ii；s5、分别将所述有效细胞i和所述有效细胞ii进行10×genomics单细胞转录组测序，并依次与参考基因组序列比对、分群、鉴定，分别筛选出所述有效细胞i中的脂肪亚群i和所述有效细胞ii中的脂肪细胞亚群ii；s6、对所述脂肪细胞亚群i和所述脂肪细胞亚群ii分别进行单细胞转录组测序，发现所述ensoarg00000019070基因在脂肪细胞亚群i中的表达量明显高于脂肪细胞亚群ii中的表达量，即完成筛选。
12、本专利技术的有益效果是：该方法利用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)灵敏度高、特异性好、可准确定量的特点，通过对肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的定量检测，可对肌内脂肪沉积前骨骼肌中肌内前体脂肪细胞的含量进行评估，进而选择肌内脂肪沉积能力强肉羊个体进行育种，实现了早期选种，可大大提高肉羊选育的准确性，为肉羊肉质品质的选育提供便捷的技术手段。
13、进一步，上述s2中，所述d360与所述i型胶原酶的体积比为1:(4.5-5.5)，所述d1与所述i型胶原酶的体积比为1:(9.5-10.5)。
14、其中d360和d1在与i型胶原酶混合前还需要用pbs冲洗，直至pbs变清亮，然后剔除可见血管和结缔组织，反复剪至肉糜状，转移至50ml一次性无菌离心管内，每管约5g组织样品，之后再与i型胶原酶混合。
15、本专利技术上述进一步有益效果是：该比例区间能够使i型胶原酶充分消化d360和d1中的纤维，而由于d1为刚出生的小羊，其胶原纤维含量更多，因此更难消化，需要添加较多的i型胶原酶，而成年羊中胶原纤维含量更少，因此添加的i型胶原酶也较少；而该添加区间不会因为i型胶原酶的添加量过多而导致浪费，也不会因为i型胶原酶的添加量过少而导致消化不完全。
16、第六方面，本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记，其特征在于，所述绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记为ENSOARG00000019070基因，所述ENSOARG00000019070基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于扩增如权利要求1所述的绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种如权利要求1所述的绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记在评估绵羊肌内脂肪沉积能力中的应用。
4.一种用于评估绵羊肌内脂肪沉积能力的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的用于扩增绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的引物。
5.一种筛选如权利要求1所述的绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的筛选绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的方法，其特征在于，所述S2中，所述D360与所述I型胶原酶的体积比为1:(4.5-5.5)
7.一种评估绵羊肌内脂肪沉积能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：通过实时荧光定量PCR和构建如权利要求1所述的ENSOARG00000019070基因的表达量与肌内脂肪含量的线性回归方程，即完成评估。
8.根据权利要求7所述的评估绵羊肌内脂肪沉积能力的方法，其特征在于，所述实时荧光定量转录的程序如下：预变性95℃、2min，然后进入扩增程序，95℃、30s，60℃、30s，共计40个循环，60℃延伸结束后收集荧光信号。
9.根据权利要求7所述的评估绵羊肌内脂肪沉积能力的方法，其特征在于，所述构建线性回归方程包括如下步骤：采用所述实时荧光定量转录测得的所述ENSOARG00000019070基因的相对表达量和GPO-PAP酶法测得的绵羊背最长肌中肌内前体脂肪细胞的含量构建线性回归方程。
10.根据权利要求9所述的评估绵羊肌内脂肪沉积能力的方法，其特征在于，所述线性回归方程的方程式为：y＝11.256x+3.137，相关系数为0.9795，其中x为所述ENSOARG00000019070基因的相对表达量，y为所述绵羊背最长肌中肌内前体脂肪细胞的含量。
...【技术特征摘要】
1.一种绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记，其特征在于，所述绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记为ensoarg00000019070基因，所述ensoarg00000019070基因的cdna序列如seq id no.1所示。
2.一种用于扩增如权利要求1所述的绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.一种如权利要求1所述的绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记在评估绵羊肌内脂肪沉积能力中的应用。
4.一种用于评估绵羊肌内脂肪沉积能力的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的用于扩增绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的引物。
5.一种筛选如权利要求1所述的绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的筛选绵羊肌内前体脂肪细胞特异性分子标记的方法，其特征在于，所述s2中，所述d360与所述i型胶原酶的体积比为1:(4.5-5.5)，所述d1与所述i型胶原酶的体积比为1:...
【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，王世银，邓双义，高莉，赵永旭，郭庆河，宁程程，杨力伟，刘晓娜，高家良，
申请(专利权)人：新疆农业职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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