【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种工程化细胞外囊泡、其制备方法及应用。
技术介绍
1、细胞外囊泡(extracellular vesicle,ev)是由细胞分泌的，能够被受体细胞摄取的膜性囊泡小体，直径大约为30-1000nm。ev作为蛋白质、rna、脂质等生物大分子在细胞间转运的载体，是细胞与细胞间通讯的重要媒介。因ev广泛存在于人体的各种体液中，既可以作为液体活检的样本来源，也被认为是一种天然驯化的药物载体。
2、ev可作为药物载体携带和运输“货物”，例如具有治疗效果的多肽和蛋白。为了让ev携带的货物蛋白能够发挥效果，需要确保货物蛋白在ev内的量足够高。然而，在细胞中异源表达的非外泌体货物蛋白并不会被主动分拣到细胞外囊泡中。
3、根据已有的报道，目前有约20种蛋白被报道可用于货物蛋白在ev中的装载(theranostics,2019；9(4):1015-1028)。wo2013084000a2、wo2014168548a2、wo2018015535a1、wo2019040920a1等专利申请也描述了将蛋白装载到ev的方法。
技术实现思路
1、本申请的专利技术人在研究中意外发现一种多肽能够将与之融合的货物蛋白携带并富集至细胞外囊泡中，命名为内载多肽，在此基础上完成本专利技术。
2、在第一个方面，本专利技术提供一种融合蛋白，其包含内载多肽和货物蛋白，所述内载多肽位于所述货物蛋白的n端，所述内载多肽包含一个或更多个豆蔻酰化位点和一个或更多个棕
3、在一些实施方案中，所述豆蔻酰化位点和所述棕榈酰化位点间隔0至6个氨基酸，例如，间隔0、1、2、3、4、5或6个氨基酸。
4、在另一些实施方案中，所述内载多肽包含式(i)所示的片段，
5、mgx1mcx2n(i)，其中
6、所述式(i)片段长度不小于10个氨基酸，x1和x2各自独立地是任意氨基酸；
7、m为0至6的整数，例如0、1、2、3、4、5或6；
8、n为正整数，例如1至300、2至200、3至100、4至80、5至60或7至30的整数；
9、其中，当m大于1时，所述至少2个x1各自独立地是任意氨基酸；当n大于1时，所述至少2个x2各自独立地是任意氨基酸。
10、在另一些实施方案中，所述内载多肽包含式(ii)所示的片段，
11、mgx1mcx3x4x5x6x7x8x9(ii)，其中
12、m为0至3的整数，例如0、1、2或3；
13、x3选自r、t、l和f，x4选自q、v、l、g、y和p，x5选自s、n、g和c，x6选自s、a、n和p，x7选自e、k、s、n和g，x8选自e、d、t、k和m，和x9选自k、r、e、t和s。
14、在另一些实施方案中，所述内载多肽选自如下序列：
15、
16、
17、在一些优选实施方案中，所述内载多肽选自如下序列：
18、gnaz(1-10)：mgcrqsseek(seq id no:12)，
19、gnai3(1-10)：mgctlsaedk(seq id no:11)，和
20、svip(1-10)：mglcfpcpge(seq id no:9)。
21、在另一些实施方案中，所述内载多肽包含gnaz、gnai1、gnai2、gnai3、gnao、gnas1、gnas2、gnal或svip的n末端起前10个、前15个、前20个、前25个、前32个、前42个或前50个氨基酸。本文所指“n末端起前10个氨基酸”，是指从n端第1个氨基酸至第10个氨基酸；“n末端起前15个氨基酸”，是指从n端第1个氨基酸至第15个氨基酸；以此类推。gnaz、gnai1、gnai2、gnai3、gnao、gnas1、gnas2、gnal均属于g-alpha家族成员。
22、在另一些实施方案中，所述内载多肽包含一个携带正电荷氨基酸残基的多肽片段，所述携带正电荷氨基酸残基的多肽片段形成α螺旋，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的所述正电荷氨基酸残基位于所述α螺旋的同侧。本文所指“α螺旋”(α-helix)具有本领域技术人员理解的含义，是一种常见的蛋白质二级结构，多肽链主链围绕中心轴有规律地螺旋式上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，是一种很稳定的结构。本专利技术所述内载多肽包含的α螺旋意指一个完整的α螺旋或α螺旋的一部分(α螺旋片段)。本文所述“至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的所述正电荷氨基酸残基位于所述α螺旋的同侧”，是指经过所述α螺旋的中心轴存在一个纵向切面，所述α螺旋肽段的正电荷氨基酸残基至少70％、至少80％、至少90％或至少95％位于切面的一侧。
23、在一些实施方案中，所述内载多肽包含选自如下的序列：
24、gnaz(1-32)：mgcrqsseekeaarrsrridrhlrsesqrqrr(seq id no:1)，
25、gnai1(1-32)：mgctlsaedkaaverskmidrnlredgekaar(seq id no:2)，
26、gnai2(1-32)：mgctvsaedkaaaerskmidknlredgekaar(seq id no:3)，
27、gnai3(1-32)：mgctlsaedkaaverskmidrnlredgekaak(seq id no:4)，
28、gnao(1-32)：mgctlsaeeraalerskaieknlkedgisaak(seq id no:20)，
29、gnas2(1-32)：mgclgnsktedqrneekaqreankkiekqlqk(seq id no:21)，和
30、gnal(1-32)：mgclggnskttedqgvdekerreankkiekql(seq id no:22)。
31、在一些优选实施方案中，所述内载多肽选自如下的序列：
32、gnaz(1-32)：mgcrqsseekeaarrsrridrhlrsesqrqrr(seq id no:1)，
33、gnai1(1-32)：mgctlsaedkaaverskmidrnlredgekaar(seq id no:2)，
34、gnai2(1-32)：mgctvsaedkaaaerskmidknlredgekaar(seq id no:3)，
35、gnai3(1-32)：mgctlsaedkaaversk本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其包含内载多肽和货物蛋白，所述内载多肽位于所述货物蛋白的N端，所述内载多肽包含一个或更多个豆蔻酰化位点和一个或更多个棕榈酰化位点。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述豆蔻酰化位点和所述棕榈酰化位点间隔0至6个氨基酸，例如，间隔0、1、2、3、4、5或6个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含式(I)所示的片段，
4.根据权利要求1至3任一所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含式(II)所示的片段，
5.根据权利要求1至4任一所述的融合蛋白，其中所述内载多肽选自如下序列：
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述内载多肽选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
7.根据权利要求1至4任一所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含GNAZ、GNAI1、GNAI2、GNAI3、GNAO、GNAS1、GNAS2、GNAL或SVIP的N末端起前10个、前15个、前20个、前25个、前32个、前42个或前50个氨基酸。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含选自如下的序列：
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述内载多肽选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:21。
11.根据权利要求1至10任一所述的融合蛋白，其中所述货物蛋白是治疗性肽、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、荧光蛋白、酶或连接治疗化合物的接头。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述治疗性肽是抗体和/或细胞因子，例如所述细胞因子选自人白细胞介素家族成员(例如，IL-2,IL-7,IL-10,IL-11,IL-12,IL-15和IL-23)，肿瘤坏死因子家族成员(例如，TNF,LTA,LTB,FASLG,TNFSF8,TNFSF9,TNFSF10,TNFSF11,TNFSF12,TNFSF13,TNFSF14,TNFSF15,TNFSF18和EDA)，干扰素(INF-α,INF-β和INF-γ)，T cellengager(例如，4-1BB,OX40,CD28,CD40,CD40L,CD47,CD27,CD70,CD80,CD86,GITRL,ICOSL,CD155,CD112,TIM-3,BTLA)，和其他细胞因子(例如，G-CSF,EPO,TPO,GM-CSF,EGF,bFGF,FVIIa,ATⅢ,TNK,α-Glucosidase,BMP-2,hirudin)。
13.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述RNA结合蛋白选自L7Ae、hnRNPA2B1、hnRNPC1、hnRNPG、hnRNPK、hnRNPQ、YBX1、HuR、AGO2、IGF2BP1、MEX3C、ANXA2、ALIX、NCL、FUS和MVP。
14.一种工程化细胞外囊泡，其包含如权利要求1至13任一所述的融合蛋白。
15.根据权利要求14所述的细胞外囊泡，其包含两种或更多种融合蛋白，例如所述两种或更多种融合蛋白各自独立地包含不同的货物蛋白。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至13任一所述融合蛋白或权利要求14或15所述的细胞外囊泡和药学上可接受的载体。
17.一种工程化细胞，其用于生产根据权利要求14或15所述的细胞外囊泡。
18.根据权利要求17所述的细胞，其包含编码所述融合蛋白的多核苷酸，优选地，所述多核苷酸整合在所述细胞的基因组中。
19.一种治疗疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用如权利要求1至13任一所述的融合蛋白、如权利要求14所述的细胞外囊泡、如权利要求16所述的药物组合物或如权利要求17所述的细胞。
20.一种细胞外囊泡成像方法，其包括在所述细胞外囊泡中装载如权利要求1至13任一所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白为荧光蛋白或荧光素酶，优选地，所述荧光蛋白选自GFP(Green fluorescent protein)、RFP(Red fluorescent protein)、YFP(Yellowfluorescent protein)和CP(Chromoprotein)；优选地，所述荧光素酶选自萤火虫荧光素...
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其包含内载多肽和货物蛋白，所述内载多肽位于所述货物蛋白的n端，所述内载多肽包含一个或更多个豆蔻酰化位点和一个或更多个棕榈酰化位点。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述豆蔻酰化位点和所述棕榈酰化位点间隔0至6个氨基酸，例如，间隔0、1、2、3、4、5或6个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含式(i)所示的片段，
4.根据权利要求1至3任一所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含式(ii)所示的片段，
5.根据权利要求1至4任一所述的融合蛋白，其中所述内载多肽选自如下序列：
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述内载多肽选自seq id no:9、seq id no:11和seq id no:12。
7.根据权利要求1至4任一所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含gnaz、gnai1、gnai2、gnai3、gnao、gnas1、gnas2、gnal或svip的n末端起前10个、前15个、前20个、前25个、前32个、前42个或前50个氨基酸。
8.根据权利要求1至4任一所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含一个携带正电荷氨基酸残基的多肽片段，所述携带正电荷氨基酸残基的多肽片段形成α螺旋，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的所述正电荷氨基酸残基位于所述α螺旋的同侧。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述内载多肽包含选自如下的序列：
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述内载多肽选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:21。
11.根据权利要求1至10任一所述的融合蛋白，其中所述货物蛋白是治疗性肽、dna结合蛋白、rna结合蛋白、荧光蛋白、酶或连接治疗化合物的接头。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述治疗性肽是抗体和/或细胞因子，例如所述细胞因子选自人白细胞介素家族成员(例如，il-2,il-7,il-10,il-11,il-12,il-15和il-23)，肿瘤坏死因子家族成员(例如，tnf,lta,ltb,faslg,tnfsf8,tnfsf9,tnfsf10,tnfsf11,tnfsf12,tnfsf13,tnfsf14,tnfsf15,tnfsf18和eda)，干扰素(...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵立波，孔关义，李鸿艳，李志，陈静，
申请(专利权)人：北京恩康医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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