【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物药制剂，具体涉及一种外泌体保护液及其应用。
技术介绍
1、外泌体是生物细胞分泌的双层脂膜外囊泡（extracellular vesicles，evs），其中包裹有dna/rna、蛋白质、脂类、糖类、各类代谢物质，粒径在30-150 nm范围内。与脂质体、aav和慢病毒等传统的药物载体相比，外泌体具有低免疫原性和良好的生物兼容性等优势。然而，外泌体具有体外不稳定的显著缺陷，易发生非特异性吸附及长期冷冻储存时生物活性显著降低。因此，开发一种针对于各种外泌体，且储存方式不受限制的同时提高外泌体的体外稳定性的保护液，这对促进外泌体的相关研究及应用具有重要意义。
2、保护液配方开发一方面是找到能提供稳定的溶液条件以支持外泌体分子及其相关生物大分子的高阶结构，为其在制备、生产、使用过程中受到的各种应激条件提供稳定性支撑，从而维持整个体系稳定。另一方面也是通过各种赋形剂为外泌体在制剂研发过程中提供更多可能性，从而使其具有更广泛的应用价值。
3、专利sg11202203037sa公开了一种组合物，其成分为外泌体、糖类、氯化钠、磷酸钾和磷酸钠，该组合物处于ph约7.0-7.4的溶液中，糖类的浓度范围在1%-5%，电导率在6 ms/cm±10%~10 ms/cm±10%，nacl的浓度范围在10 mm-134 mm，磷酸盐缓冲液包含钾磷酸盐和磷酸钠，其比例为1:2-1:5，-80℃~-20℃范围内储存。但是上述组合物适用于-80℃~-20℃范围内储存，对于其他的温度范围难以适用。
4、专利us2
5、专利cn115885980a公开了一种外泌体冷藏保护液及应用，所述保护液包括浓度1%-20%的海藻糖、浓度5%-30%的甘露醇、浓度0.1%-1%的聚乙烯醇、浓度1%-10%的甘油、浓度0.5%-5%的脂质体、浓度3%-30%的大豆油和浓度1%-10%的血清替代物，溶剂采用生理盐水。所述冷藏保护液对人体几乎无毒害作用、且成本较低，能够在非冷冻条件下对外泌体提供长期有效的保护，让外泌体在0℃以上冷藏条件下长期保存。但是上述冷藏保护液对于-80℃~-20℃条件下冷冻却不适用，因此，其使用场景有限。
6、专利cn115968867a公开了一种外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法，所述外泌体冻干保护剂以10-50 mmol/l的tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在所述缓冲体系中的工作浓度计，还包括糖类物质1-5% w/v、醇类物质1-5% w/v、明胶水解物0.1-0.5%w/v和精氨酸50-500 mmol/l。该外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法缓解了现有技术中存在的冻干保护剂无法有效的维持外泌体冻干后生物活性的技术问题。上述冻干保护剂主要应用于冻干，并不适用于外泌体冷藏。
7、外泌体一类细胞外囊泡，具有在生物体内广泛的分布性和获取的便捷性，作为一种新型细胞间通讯的物质，已经成为疾病诊断治疗的潜在有效方式，在精准医疗上也有着光明的前景。外泌体具有天然双层脂膜的囊泡结构，其稳定性较好。与其它纳米药物递送系统如脂质体、腺病毒相比，它穿透性极强、吸收更佳、低免疫原性。常规使用、储存方式是将外泌体长期置于pbs磷酸盐缓冲液中于2~8℃使用，于-80℃冻存。虽然pbs磷酸盐缓冲液可为其提供人体体液类似的渗透压和ph值，但在维持外泌体稳定性方面仍具有一定局限性。首先，无论是冷藏、冻存还是冻干pbs均无法提供更多功效以防止外泌体聚集，生物特性、标志物改变和含量、活性的降低。使得外泌体保存时间短，存储运输成本高，应用范围窄。其次，目前外泌体进展主要处于早期研究阶段，即使为数不多产品已经进入早期临床，也主要用于疾病诊断、预后监测等方面。若能开发一种安全、有效、稳定、适用于外泌体的配方，即可适用于外泌体早期研发，又可形成制剂用于临床。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种外泌体保护液及其应用。本专利技术提供一种药用级别的外泌体保护液，通过选取满足药用标准的辅料为后期临床研究提供基础；所述保护液适用于不同来源外泌体，即可作为冻存液也可作为冻干保护剂，适用的温度范围广，包括-80℃~25℃（采用所述保护液冻干外泌体后，可稳定保存于5-25℃，采用所述保护液冻存外泌体后，可稳定保存于-80℃~5℃），所述保护液能够降低外泌体储存运输成本，扩大外泌体适用范围；使用上述保护液能够提高外泌体在储存中的稳定性和保持外泌体的完整性功效，还具有减少外泌体聚集的功效，提高evs上目标蛋白的稳定性。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种外泌体保护液，所述保护液包括：糖类赋形剂、甘油、泊洛沙姆p188、组氨酸、盐酸精氨酸、脯氨酸和氯化钠。
4、优选地，所述糖类赋形剂选自海藻糖和/或蔗糖。
5、本专利技术中，所述保护液中各组分按功能分包括赋形剂、表面活性剂、胞内渗透压调节剂、渗透压调节剂、缓冲体系和稳定剂。按组成类型分包括糖类、多元醇、表面活性剂类、盐和氨基酸等。其中糖类、多元醇、表面活性剂类、氨基酸可以统称为低温保护剂。
6、其中，低温保护剂之所以能维持外泌体的稳定性，一是在水溶液中，水分子与外泌体表面的某些极性基团相互作用，使外泌体优先水合。在冷冻过程的初始阶段，低温保护剂被选择性地排除在外泌体附近。这种溶质分子的排除增加了展开的自由能，从而有利于维持稳定的自然状态。二是低温保护剂的存在导致冷冻浓缩物的粘度增加，从而降低了分子的流动性，从而减缓了所有的动态过程。若外部条件不利于外泌体稳定性时，蛋白表面结合的低温保护剂更容易先被除去，这有利于天然蛋白构象的维持。
7、在本专利技术中，由于所述保护液既要在-80℃~5℃条件下冻存，又要适用于冻干，故玻璃化转变温度低的山梨糖醇和低温条件下易结晶的甘露醇被优先排除。此外，考虑到还原性糖易与外泌体中蛋白质上的伯胺基团发生美拉德反应，故乳糖排除在外。蔗糖、海藻糖是一种天然的、无毒的糖，被生物医药行业广泛用作蛋白质稳定剂和低温保护剂。并且其高的玻璃化转变温度可最大程度地降低分子的迁移率，同时通过充当良好的“水代用品”，从而保持干燥状态下的自然状态是冻干保护剂的两个关键属性。故本专利技术采用海藻糖或蔗糖作为低温保护剂。
8、本专利技术中，所述糖类赋形剂更优选为海藻糖，相比于蔗糖，海藻糖在不同的干燥或失水过程中，包括冷冻干燥，海藻糖可轻易地干燥为非晶体材料，并具有高玻璃态转变温度（tg＞100°c），有利于提供体系的玻璃化转变温度，从而提供产品储存过程中的稳定性；海藻糖在ph＜5环境下不易本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种外泌体保护液，其特征在于，所述保护液包括：糖类赋形剂、甘油、泊洛沙姆P188、组氨酸、盐酸精氨酸、脯氨酸和氯化钠。
2.根据权利要求1所述的外泌体保护液，其特征在于，所述糖类赋形剂选自海藻糖和/或蔗糖。
3.根据权利要求2所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液中各组分按浓度计包括：5-8% w/v糖类赋形剂、0.1-0.4% w/v泊洛沙姆P188、0.01-0.15% w/v甘油、0.1-1.0 mg/mL组氨酸、5-20 mg/mL盐酸精氨酸、5-25 mg/mL脯氨酸和0.1-1.5 mg/mL氯化钠。
4.根据权利要求3所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液中各组分按浓度计包括：6-7% w/v糖类赋形剂、0.2-0.3% w/v泊洛沙姆P188、0.05-0.1% w/v甘油、0.2-0.8 mg/mL组氨酸、10-15 mg/mL盐酸精氨酸、10-15 mg/mL脯氨酸和0.5-1 mg/mL氯化钠。
5.根据权利要求4所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液的pH为6.5-8.0。
6.根
7.根据权利要求6所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液的使用温度为-80℃~25℃。
8.一种外泌体组合物，其特征在于，所述组合物中包括权利要求1-7中任一项所述的外泌体保护液和外泌体。
9.权利要求1-7中任一项所述的外泌体保护液在制备含外泌体的药物中的应用。
10.权利要求1-7中任一项所述的外泌体保护液在外泌体储存中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种外泌体保护液，其特征在于，所述保护液包括：糖类赋形剂、甘油、泊洛沙姆p188、组氨酸、盐酸精氨酸、脯氨酸和氯化钠。
2.根据权利要求1所述的外泌体保护液，其特征在于，所述糖类赋形剂选自海藻糖和/或蔗糖。
3.根据权利要求2所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液中各组分按浓度计包括：5-8% w/v糖类赋形剂、0.1-0.4% w/v泊洛沙姆p188、0.01-0.15% w/v甘油、0.1-1.0 mg/ml组氨酸、5-20 mg/ml盐酸精氨酸、5-25 mg/ml脯氨酸和0.1-1.5 mg/ml氯化钠。
4.根据权利要求3所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液中各组分按浓度计包括：6-7% w/v糖类赋形剂、0.2-0.3% w/v泊洛沙姆p188、0.05-0.1% w...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷炜，吴成恩，王建武，张林聪，赵亚超，孔关义，赵立波，
申请(专利权)人：北京恩康医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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